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lloveyr

金虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by huiee at 2011-11-15 02:07:58:
我想问一下 PKD46 是啥质粒 是温度敏感性origin的质粒吗
还有PCP20是啥质粒 怎么消除氯霉素

这两个质粒都是温度敏感的 提高培养温度就会丢掉质粒
11楼2011-11-15 17:39:34
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illcf_11

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by lloveyr at 2011-10-29 17:45:59:
菌会自发产生抗性,一直用氯霉素挑选,会有可能将这种自发产生的抗性强化。我以前做这个实验时遇到过这种问题,给个建议而已

这个和同源臂相关,不同长度和位置设计同源臂,在敲除时还是有区别的。另外电转的时候,打靶基因纯化不要有离子,浓度高点比较好,我的在200ng/ul以上,电转的感受态制备也是关键,要保证效率
12楼2011-11-24 08:46:30
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gandalf886

银虫 (小有名气)

引用回帖:
1楼: Originally posted by illcf_11 at 2011-10-27 10:47:54:
小妹这些时间在做red基因重组技术,遇到pkd46质粒在高温下(42度甚至45度)还无法消除。具体步骤如下:
1、将PKD46化转到W3110中,挑取单克隆,提取质粒,初步验证后,接种至AMP培养基中30度过夜培养,次日1:10 ...

42度液体多转接几代(不加抗生素),稀释后涂无抗平板,42度培养,然后无抗平板传代,同时划线amp平板,肯定能消掉的
13楼2011-11-25 17:36:09
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clx@6016

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by huiee at 2011-11-15 02:07:58:
我想问一下 PKD46 是啥质粒 是温度敏感性origin的质粒吗
还有PCP20是啥质粒 怎么消除氯霉素

PKD46是表达Exo、Bet和Gam三基因片段的质粒,3个基因置于阿拉伯糖启
动子下,经L一阿拉伯糖诱导就可以大量表达。同时pKD46还具有温度敏感型复制子,该质粒在42℃时不能复制,自然丢失。
Pcp20是表达FLP重组酶基因的质粒,FLP重组酶可以与FRT位点结合,在FLP重组酶的作用下,FRT位点自身发生同源重组,从而消除FRT位点及抗性基因。复制子为温度敏感型,重组酶FLP在42℃时诱导表达,同时质粒也逐渐被消除。
14楼2011-12-02 21:24:30
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clx@6016

金虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by illcf_11 at 2011-11-24 08:46:30:
这个和同源臂相关,不同长度和位置设计同源臂,在敲除时还是有区别的。另外电转的时候,打靶基因纯化不要有离子,浓度高点比较好,我的在200ng/ul以上,电转的感受态制备也是关键,要保证效率

可是如何才能提高电转感受态的效率呢???
  我做的感受态细胞效率一直很低,怎么样才能提高呢?还望高手多多赐教,可以的话,说下电转感受态细胞的制备过程哈,越详细越好哦!
       嘿嘿~感激ing。。。。。。
15楼2011-12-02 21:31:37
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元雪浈

银虫 (初入文坛)

即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况,如果还想用这株菌该怎么办呢
祝各位虫友实验顺利!
16楼2012-08-30 10:44:57
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元雪浈

银虫 (初入文坛)

感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
 一、 受体菌的培养

  从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。

二. 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

  2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

  3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

  4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
希望对你有所帮助
祝各位虫友实验顺利!
17楼2012-08-30 10:48:32
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jndxwjl

新虫 (初入文坛)

这个pKD46去除不掉的情况我也遇到过,我改进的方法是减小接种量,然后立即置于42℃摇,3-4h划线于基因组抗性平板,并置于42℃培养,然后,选择单菌落在amp抗性平板划线,不长的单菌落,说明其pkd46已经去除。
18楼2012-10-18 22:14:10
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tianhome

木虫 (知名作家)

试试用低磷培养基传代,祝好运
虫洞
19楼2013-09-19 07:14:44
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2011sp

铁杆木虫 (著名写手)

这个质粒不是温敏型的,所以你去除不掉。
20楼2014-05-31 20:48:56
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