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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了
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lloveyr

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by huiee at 2011-11-15 02:07:58:
我想问一下 PKD46 是啥质粒 是温度敏感性origin的质粒吗
还有PCP20是啥质粒 怎么消除氯霉素

这两个质粒都是温度敏感的 提高培养温度就会丢掉质粒
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11楼2011-11-15 17:39:34
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illcf_11

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lloveyr at 2011-10-29 17:45:59:
菌会自发产生抗性，一直用氯霉素挑选，会有可能将这种自发产生的抗性强化。我以前做这个实验时遇到过这种问题，给个建议而已

这个和同源臂相关，不同长度和位置设计同源臂，在敲除时还是有区别的。另外电转的时候，打靶基因纯化不要有离子，浓度高点比较好，我的在200ng/ul以上，电转的感受态制备也是关键，要保证效率
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12楼2011-11-24 08:46:30
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gandalf886

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by illcf_11 at 2011-10-27 10:47:54:
小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下：
1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：10 ...

42度液体多转接几代（不加抗生素），稀释后涂无抗平板，42度培养，然后无抗平板传代，同时划线amp平板，肯定能消掉的
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13楼2011-11-25 17:36:09
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clx@6016

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by huiee at 2011-11-15 02:07:58:
我想问一下 PKD46 是啥质粒 是温度敏感性origin的质粒吗
还有PCP20是啥质粒 怎么消除氯霉素

PKD46是表达Exo、Bet和Gam三基因片段的质粒，3个基因置于阿拉伯糖启
动子下，经L一阿拉伯糖诱导就可以大量表达。同时pKD46还具有温度敏感型复制子，该质粒在42℃时不能复制，自然丢失。
Pcp20是表达FLP重组酶基因的质粒，FLP重组酶可以与FRT位点结合，在FLP重组酶的作用下，FRT位点自身发生同源重组，从而消除FRT位点及抗性基因。复制子为温度敏感型，重组酶FLP在42℃时诱导表达，同时质粒也逐渐被消除。
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14楼2011-12-02 21:24:30
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clx@6016

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by illcf_11 at 2011-11-24 08:46:30:
这个和同源臂相关，不同长度和位置设计同源臂，在敲除时还是有区别的。另外电转的时候，打靶基因纯化不要有离子，浓度高点比较好，我的在200ng/ul以上，电转的感受态制备也是关键，要保证效率

可是如何才能提高电转感受态的效率呢？？？
  我做的感受态细胞效率一直很低，怎么样才能提高呢？还望高手多多赐教，可以的话，说下电转感受态细胞的制备过程哈，越详细越好哦！
       嘿嘿~感激ing。。。。。。
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15楼2011-12-02 21:31:37
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元雪浈

银虫 (初入文坛)
即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况，如果还想用这株菌该怎么办呢
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祝各位虫友实验顺利！
16楼2012-08-30 10:44:57
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元雪浈

银虫 (初入文坛)
感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
　一、 受体菌的培养

　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

二.　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
希望对你有所帮助
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祝各位虫友实验顺利！
17楼2012-08-30 10:48:32
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jndxwjl

新虫 (初入文坛)
这个pKD46去除不掉的情况我也遇到过，我改进的方法是减小接种量，然后立即置于42℃摇，3-4h划线于基因组抗性平板，并置于42℃培养，然后，选择单菌落在amp抗性平板划线，不长的单菌落，说明其pkd46已经去除。
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18楼2012-10-18 22:14:10
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tianhome

木虫 (知名作家)
试试用低磷培养基传代，祝好运
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虫洞
19楼2013-09-19 07:14:44
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2011sp

铁杆木虫 (著名写手)
这个质粒不是温敏型的，所以你去除不掉。
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20楼2014-05-31 20:48:56
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