| 查看: 7896 | 回复: 25 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了
|
||
|
小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下： 1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：1000转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入，阿拉伯糖至终浓度100mM,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞。 2、将打靶分子（pkd3来源，氯霉素抗性）200ng左右，1800V,4.1至4.3ms电转至感受态中，37度培养2h后，涂布于氯霉素抗性的LB平板，37度过夜培养。 3、将氯霉素平板上长出的克隆，再次在氯霉素板上划线，并PCR验证基因组是否敲除。阳性结果再制备化转感受态，准备将pcp20转进去，将氯霉素抗性消除。可是次日 平板上的克隆数巨多。 推测是在制备感受态的时候之前的pkd46没有消除。于是将具有氯霉素抗性的单克隆接种至摇瓶，提高培养温度至42甚至45度，企图消除内涵的pkd46，转接数次，划线amp平板，均生长状态良好。如今我无法消除pkd46，严重影响后面转化pcp20后，阳性克隆的挑选率。 哪位高手能指教一下……到底哪里出错，或是可以怎么解决 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有172人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
tianhome
木虫 (知名作家)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 13221.5
- 散金: 34
- 红花: 61
- 帖子: 6157
- 在线: 1048.2小时
- 虫号: 2101317
- 注册: 2012-11-02
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
19楼2013-09-19 07:14:44
yanhua_2006
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 22 (小学生)
- 金币: 6472.8
- 散金: 668
- 红花: 10
- 帖子: 1936
- 在线: 86.8小时
- 虫号: 320313
- 注册: 2007-03-10
- 专业: 微生物遗传育种学
3楼2011-10-27 13:46:34
wanhscn
木虫 (职业作家)
哲学@草根
- MolEPI: 26
- 应助: 53 (初中生)
- 贵宾: 0.87
- 金币: 3895.7
- 散金: 877
- 红花: 27
- 沙发: 14
- 帖子: 3642
- 在线: 526.2小时
- 虫号: 1376762
- 注册: 2011-08-22
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
4楼2011-10-27 16:13:09
lloveyr
金虫 (正式写手)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1115.3
- 散金: 46
- 红花: 4
- 帖子: 919
- 在线: 73小时
- 虫号: 1356171
- 注册: 2011-07-26
- 专业: 微生物遗传学
5楼2011-10-28 15:05:51
30