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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了
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illcf_11

银虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了

小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下：
1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：1000转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入，阿拉伯糖至终浓度100mM,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞。
2、将打靶分子（pkd3来源，氯霉素抗性）200ng左右，1800V,4.1至4.3ms电转至感受态中，37度培养2h后，涂布于氯霉素抗性的LB平板，37度过夜培养。
3、将氯霉素平板上长出的克隆，再次在氯霉素板上划线，并PCR验证基因组是否敲除。阳性结果再制备化转感受态，准备将pcp20转进去，将氯霉素抗性消除。可是次日 平板上的克隆数巨多。
推测是在制备感受态的时候之前的pkd46没有消除。于是将具有氯霉素抗性的单克隆接种至摇瓶，提高培养温度至42甚至45度，企图消除内涵的pkd46，转接数次，划线amp平板，均生长状态良好。如今我无法消除pkd46，严重影响后面转化pcp20后，阳性克隆的挑选率。
哪位高手能指教一下……到底哪里出错，或是可以怎么解决
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1楼 2011-10-27 10:47:54
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602059625

金虫 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lloveyr at 2011-10-28 15:05:51:
这几个质粒我以前用过，好像没有楼主说的问题啊。在消除质粒时 ，培养液中不能加抗生素，然后在无抗性平板上划线，然后验证对单菌落进行氨苄敏感氯霉素抗性筛选（可以用传统的牙签点种法），同时要注意菌不要过多 ...

“同时要注意菌不要过多的接触氯霉素，否则会出现即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况。”
氯霉素基因已经消除怎么还会有氯霉素抗性呢
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7楼2011-10-28 21:53:57
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gandalf886

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by illcf_11 at 2011-10-27 10:47:54:
小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下：
1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：10 ...

42度液体多转接几代（不加抗生素），稀释后涂无抗平板，42度培养，然后无抗平板传代，同时划线amp平板，肯定能消掉的
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13楼2011-11-25 17:36:09
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tianhome

木虫 (知名作家)
引用回帖:
23楼: Originally posted by sparkledyd at 2018-10-29 20:24:22
您好!我现在遇到得问题也是pkD46消不掉，传了14代  高温45度传的 ，仍然消不掉！请问关于低磷培养基可以详细说下嘛...

就是在磷酸盐不足的培养基中传代，五年了，你还记得我，谢谢！
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虫洞
24楼2018-10-29 21:05:12
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普通回帖

illcf_11

银虫 (初入文坛)
没人知道么？
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2楼2011-10-27 12:32:19
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yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)
我也有遇到类似的问题，有高人能给指点一下吗？
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3楼2011-10-27 13:46:34
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
点确定回帖应助！
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真相是最大的奢侈品
4楼2011-10-27 16:13:09
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lloveyr

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

illcf_11(金币+10): 谢谢，目前已经解决了，是我们的PKD46温敏出了问题，换了新的质粒就好了 2011-11-24 08:41:55
这几个质粒我以前用过，好像没有楼主说的问题啊。在消除质粒时 ，培养液中不能加抗生素，然后在无抗性平板上划线，然后验证对单菌落进行氨苄敏感氯霉素抗性筛选（可以用传统的牙签点种法），同时要注意菌不要过多的接触氯霉素，否则会出现即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况。
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5楼2011-10-28 15:05:51
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602059625

金虫 (知名作家)
“阳性结果再制备化转感受态，准备将pcp20转进去，将氯霉素抗性消除。可是次日 平板上的克隆数巨多。”
pcp20转进去之后涂什么抗生素的平板？
这是想筛已经转进pcp20的菌吗
pcp20上有amp、kan、cm三种抗性基因，如果担心pKD46还没有消除，可以涂cm平板来筛已经转进pcp20的菌
消除基因组上的cm时应该是在无抗生素的LB中培养吧
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其实我也是做了几次还没成功
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6楼2011-10-28 21:51:21
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lloveyr

金虫 (正式写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): good!鼓励交流! 2011-11-15 17:35:07
引用回帖:
7楼: Originally posted by 602059625 at 2011-10-28 21:53:57:
“同时要注意菌不要过多的接触氯霉素，否则会出现即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况。”
氯霉素基因已经消除怎么还会有氯霉素抗性呢

菌会自发产生抗性，一直用氯霉素挑选，会有可能将这种自发产生的抗性强化。我以前做这个实验时遇到过这种问题，给个建议而已
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8楼2011-10-29 17:45:59
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fanny_21

银虫 (小有名气)
楼主，我也在做W3110的基因敲除，请教一下为什么我的线性片段电转化后总是得不到阳性克隆呢？
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9楼2011-11-03 14:20:20
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huiee

金虫 (正式写手)
我想问一下 PKD46 是啥质粒 是温度敏感性origin的质粒吗
还有PCP20是啥质粒 怎么消除氯霉素
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10楼2011-11-15 02:07:58
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