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银虫 (初入文坛)

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[求助] 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了

小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下：
1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：1000转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入，阿拉伯糖至终浓度100mM,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞。
2、将打靶分子（pkd3来源，氯霉素抗性）200ng左右，1800V,4.1至4.3ms电转至感受态中，37度培养2h后，涂布于氯霉素抗性的LB平板，37度过夜培养。
3、将氯霉素平板上长出的克隆，再次在氯霉素板上划线，并PCR验证基因组是否敲除。阳性结果再制备化转感受态，准备将pcp20转进去，将氯霉素抗性消除。可是次日平板上的克隆数巨多。
推测是在制备感受态的时候之前的pkd46没有消除。于是将具有氯霉素抗性的单克隆接种至摇瓶，提高培养温度至42甚至45度，企图消除内涵的pkd46，转接数次，划线amp平板，均生长状态良好。如今我无法消除pkd46，严重影响后面转化pcp20后，阳性克隆的挑选率。
哪位高手能指教一下……到底哪里出错，或是可以怎么解决

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