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jm0305100303

新虫 (小有名气)

[求助] 已经带his标签目的蛋白基因如何设计引物啊（目的基因已经接在pET-22b的载体上了）

分子生物学的新手，正学习设计引物，向各位大侠求助啊……
利用pET-22b的重组质粒去pcr，希望得到带组氨酸标签的目的蛋白基因，因为组氨酸标签用的是CAC，所以设计出来的引物GC%偏高（66.7%），Tm值79.2(上游引物的tm值才56.7，差20多度……)，引物里面就是保护碱基（3bp）+酶切位点（6bp）+终止密码子（3bp）+5个GTG（15bp）的重复，一共27个bp，不知道这样的引物能不能p出目的基因来啊，如果能p出来，退火温度应该用多少呢？

[ Last edited by jm0305100303 on 2011-9-19 at 13:09 ]
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1楼 2011-09-19 12:57:19
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jm0305100303 at 2011-09-20 20:55:36:
想给你金币 说是不是回复求助帖 不能给……

没有技术含量的回答，就没想要你金币，所以选的就是“不应助”，哈哈~
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6楼2011-09-20 21:04:55
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-09-20 17:52:04
jm0305100303(金币+2): 谢谢啊 2011-09-20 20:53:49
jm0305100303(金币+3): 楼下的不能给 就都给你吧 2011-09-20 20:58:14
wanhscn(金币+1): 对的，可以先试试。有的时候不能全部相信软件！ 2011-09-21 08:34:23
试试吧，不行的话，再将下游引物延长20 bp ,GC含量就降下来了。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-09-20 11:30:06
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 2011-09-21 07:53:54
现在的酶都很好了，PCR是越来越容易了。我们经常做的PCR，一条引物50bp，一条20bp，Primer Premier评分不超过5分，一样能做出来。你这不是很大的问题，按普通PCR的程序去做就是了，退火温度先用常规的55℃，不行的话再试下50℃。
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3楼2011-09-20 17:55:13
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jm0305100303

新虫 (小有名气)
西瓜: 木有问题，肯定成功！ 2011-09-21 17:09:12
我又往后延伸了20多个bp，但是后面还是gc%很高，温度最后讲到71.多，就这样了，好像用质粒pcr比较容易，引物拿去合成了，希望能p出来，也能酶切的出来，额这个新手第一次搞这个实在是不大给力啊……希望能成功
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4楼2011-09-20 20:50:12
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