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wmqouc

金虫 (著名写手)

[求助] 求助western blot

各位大侠：
我在哺乳动物细胞表达趋化因子受体CCR3（膜蛋白GPCR中的一种），采用瞬转法。在目的蛋白的C端接上了6个His。使用抗His的一抗做蛋白印记杂交。
用裂解液裂解细胞后，用蛋白印记杂交检测是否表达。
结果发现Dot blot有黑点，但是做Western blot发现没有黑点。
Western blot比Dot blot多了电泳和转膜，而Western blot中的阳性对照出来了，自己的目的蛋白一片空白，奇怪啊!
这是很奇怪啊，到底是怎么回事啊，请各位帮忙分析一下。
谢谢啊!
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宁静致远
1楼2011-09-15 21:31:48
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wmqouc(金币+1): 2011-09-16 09:22:03
用何种裂解液裂解？
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2楼2011-09-15 23:06:20
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dingnan8822

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wmqouc(金币+19): 1 2011-09-16 09:26:26
蛋白多大？阳性对照是actin么？上样量是不是有些低了？是洗底片做的还是在成像仪上看的？
有可能是蛋白转到膜上的太少，或者是本来上样量就太少，造成目的蛋白信号太弱，无法检出
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3楼2011-09-16 08:45:32
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xhjggl at 2011-09-15 23:06:20:
用何种裂解液裂解？

我用的是碧云天的RIPA裂解液（强）
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宁静致远
4楼2011-09-16 09:25:24
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dingnan8822 at 2011-09-16 08:45:32:
蛋白多大？阳性对照是actin么？上样量是不是有些低了？是洗底片做的还是在成像仪上看的？
有可能是蛋白转到膜上的太少，或者是本来上样量就太少，造成目的蛋白信号太弱，无法检出

蛋白42KDa，上样20 ul，在成像仪上看的
Dot blot很黑啊，量应该不少啊，但是为什么经过电泳、转膜后的Western blot就没有了呢
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宁静致远
5楼2011-09-16 09:29:00
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dingnan8822

铁杆木虫 (正式写手)
不好意思昨天前天出差开会去了没有上网。
我不知道你用的什么成像仪，根据我的经验成像仪显条带效果不会太好，方便的话你洗个照片看看。
另，你的阳性对照是什么，点杂交是怎么做的，大概写一下。
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6楼2011-09-17 16:16:07
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