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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酿酒酵母转化建立突变库
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wuguangxia

银虫 (初入文坛)

[交流] 酿酒酵母转化建立突变库 已有4人参与

各位虫友们好！有没有最近做酵母转化的，我想向各位大虾请教一下。
我最近做酵母转化这一块，但是需要很高的转化效率，达到一定的库容才行，也就是说建立一个突变文库，有没有人做过用连接产物直接转化酿酒酵母感受态的？？？
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1楼 2011-09-06 19:18:56
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lina_chai

新虫 (初入文坛)
★
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有，可以直接转化的
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2楼2011-09-16 10:09:41
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wuguangxia

银虫 (初入文坛)
哦 ，那你做过直接转化的么？或者看到别人做过吗，可不可以给我说一下啊谢谢你
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3楼2011-09-18 20:21:20
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lina_chai

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我做过的！与质粒转化酵母细胞的操作是不一样的！
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4楼2011-09-19 10:01:52
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★ ★
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lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-09-27 17:53:24
连接产物先转DH5a，涂板后把板上的菌落全部收集小提质粒，再转酵母感受态~连接产物直接转酵母的话转化率达不到~~楼主做Directed evolution哈~
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仕不可不弘毅，任重而道远
5楼2011-09-19 11:10:55
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wuguangxia

银虫 (初入文坛)
谢谢lina_chai ！
是的，老板让我做DNA Shuffling，都做了1年了，费劲巴拉的算是把基因改组完了，这不现在需要用酵母缺陷型菌来进行高通量筛选，看过别人的一篇论文是连接产物直接转化 酵母感受态来建立突变库的，但是我一直没做出来。连接产物先转DH5a，然后用无菌水洗下提质粒，再转化酵母感受态，但是只长出几十个菌落，还是达不到库容，不晓得哪里不对
希望大家踊跃参与讨论，共同进步！
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6楼2011-09-21 21:08:23
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tingl0087

金虫 (小有名气)
★
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我想问一下各位大侠怎么制备酵母感受态的啊？为什么我每次转化都没有菌落出现。。。
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7楼2011-09-21 22:19:28
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wuguangxia

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 感谢参与 2011-09-27 17:08:16
l)实验开始前两天，接种待转化的酵母菌株的单菌落于5mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜。
2)前一天晚上，取适量(5微升左右)的过夜培养液接种到30m1YPAD培养基，30℃振荡培养过夜，到细胞密度为 1x10，细胞/m1(0D60 =0.3一0.5)。为获得更高的转化效率，可用YPAD稀释培养液至细胞密度为  2x106细胞/m1，培养2~4h。
3)取1.2ml培养液在室温下3000g离心lmin，收集细胞。细胞用lml无菌水重
悬，室温下3000g离心lmin，沉淀细胞。
4)细胞用lml铿盐溶液(1体积10xTE缓冲液，1体积10x乙酸铿贮液，8体
积无菌超纯水，现配现用)重悬。
5)室温下3000g离心lmin，去上清，重新用0.2ml铿盐溶液重悬细胞，感受态
制备完毕。
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8楼2011-09-22 09:54:05
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wuguangxia

银虫 (初入文坛)
你可以做个对照，感受态细胞不加质粒转化涂板看看长不长
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9楼2011-09-22 09:55:09
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wuguangxia

银虫 (初入文坛)
有人做过用半乳糖作为碳源来诱导酿酒酵母表达的吗？
40%半乳糖我配了之后怎么不溶呢，能高压灭菌吗？
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10楼2011-09-26 20:31:19
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