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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 通用引物扩增细菌16S rDNA
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zxjdawn

银虫 (小有名气)

[求助] 通用引物扩增细菌16S rDNA

我用通用引物扩增细菌16S rDNA，直接菌落PCR，我试了7、8次，每次都有700bp左右的的非特异性扩增，目的片段也有，在1500bp左右，我老师说他以前一做就出来了，根本没有非特异性扩增，为什么我每次都有呢，请各位虫友帮帮我~~~PCR体系如下（50uL体系）：
10*Buffer                            5UL
MgCl2（50mM）                 2uL
引物a（10uL）                   1.5uL
引物b（10uL）                   1.5uL
dNTP（10mM）                  1uL
Taq酶（2U/uL）                 1uL
模板                                    枪头蘸取一点菌
ddH2O                                38uL
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
94度预变性5min
94度          45s
56度          45s
72度          90s
30个循环
问题到底出在哪里呢？我的退火温度从55-59度都试过，59度就没有条带了，引物从1、1.5、2uL的都试过，预变性时间从5、10、12min都试过，还试过把前一次PCR产物取1uL做模板，都有非特异性条带，为么捏？？？望大虾不吝赐教，小女先谢谢大家了~~
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走自己的路，看身边的风景~~
1楼 2011-08-19 16:12:07
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ghost9106

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-08-19 18:18:42
zxjdawn(金币+1): 谢谢 2011-08-19 22:12:17
可能是菌没有完全裂解吧，试沸水浴或延长预变性时间。
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2楼2011-08-19 16:31:23
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zxjdawn

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ghost9106 at 2011-08-19 16:31:23:
可能是菌没有完全裂解吧，试沸水浴或延长预变性时间。

可是我试过预变性时间12min了，我觉得时间应该够长了吧。。。我还试过把菌挑到ddH2O里面，95度10min，再离心取上清做模板，结果还是一样，我就弄不明白问题到底出在哪里呢？？？？
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走自己的路，看身边的风景~~
3楼2011-08-19 22:15:20
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
会不会是引物出现问题了，引物如果反复冻融的话有可能会裂解断裂。
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风雪夜归人
4楼2011-08-20 09:00:12
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zxjdawn

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-20 09:00:12:
会不会是引物出现问题了，引物如果反复冻融的话有可能会裂解断裂。

可是引物是新合成的呢，，，我现在只能怀疑是引物序列出了问题，谢谢了~~~
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走自己的路，看身边的风景~~
5楼2011-08-20 09:36:00
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hzl5888

木虫 (小有名气)
★
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-21 09:43:57
建议在菌株上找找原因，会不会是这株菌的遗传性状不稳定，或许在传代的过程中产生了突变，这是非常有可能的。
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6楼2011-08-20 10:12:56
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zxjdawn

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hzl5888 at 2011-08-20 10:12:56:
建议在菌株上找找原因，会不会是这株菌的遗传性状不稳定，或许在传代的过程中产生了突变，这是非常有可能的。

谢谢了，我本来是要鉴定乳杆菌，可是我也试过我自己分离到的解淀粉芽孢杆菌，结果没差异，两株菌都变异的可能性应该微乎其微吧。。。
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走自己的路，看身边的风景~~
7楼2011-08-20 10:27:03
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j2

木虫 (正式写手)
★
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-21 09:44:11
为什么非要跑出一条带不可？直接切1500bp的胶回收就是了塞
通用引物在菌株基因的其他位置结合很正常吧~~~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
8楼2011-08-20 13:06:37
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-21 09:44:29
有就有呗。那不是主要问题。胶回收目的片段，回收产物作模板再p一次。就ok了。
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9楼2011-08-20 21:56:15
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hzl5888

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
adslye(金币+2): 感谢交流，祝顺利！ 2011-08-22 08:56:18
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-08-22 12:34:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by zxjdawn at 2011-08-20 10:27:03:
谢谢了，我本来是要鉴定乳杆菌，可是我也试过我自己分离到的解淀粉芽孢杆菌，结果没差异，两株菌都变异的可能性应该微乎其微吧。。。

如果菌株没有问题的话，建议在组分浓度上找找原因，因为我这里看不到你的引物浓度，会不会是引物浓度太高，如果引物的浓度很高产生引物二聚体的概率就比较高。也有可能是菌株不纯，还有可能是体系中出现了污染。虽然我没有做过你说的这个扩增，但是我做荧光定量时出现非特异性扩增都会从以上几方面找原因，我想既然都是PCR，原理都是一样的，分析原因应该也可以通用吧。希望能帮到你。
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10楼2011-08-21 22:13:23
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