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zxjdawn

银虫 (小有名气)

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虫号: 1165600
注册: 2010-12-08
性别: MM
专业: 食品科学基础

[求助] 通用引物扩增细菌16S rDNA

我用通用引物扩增细菌16S rDNA，直接菌落PCR，我试了7、8次，每次都有700bp左右的的非特异性扩增，目的片段也有，在1500bp左右，我老师说他以前一做就出来了，根本没有非特异性扩增，为什么我每次都有呢，请各位虫友帮帮我~~~PCR体系如下（50uL体系）：
10*Buffer                         5UL
MgCl2（50mM）                2uL
引物a（10uL）                1.5uL
引物b（10uL）                1.5uL
dNTP（10mM）                1uL
Taq酶（2U/uL）                1uL
模板                                  枪头蘸取一点菌
ddH2O                               38uL
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
94度预变性5min
94度       45s
56度       45s
72度       90s
30个循环
问题到底出在哪里呢？我的退火温度从55-59度都试过，59度就没有条带了，引物从1、1.5、2uL的都试过，预变性时间从5、10、12min都试过，还试过把前一次PCR产物取1uL做模板，都有非特异性条带，为么捏？？？望大虾不吝赐教，小女先谢谢大家了~~

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