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通用引物扩增细菌16S rDNA
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我用通用引物扩增细菌16S rDNA，直接菌落PCR，我试了7、8次，每次都有700bp左右的的非特异性扩增，目的片段也有，在1500bp左右，我老师说他以前一做就出来了，根本没有非特异性扩增，为什么我每次都有呢，请各位虫友帮帮我~~~PCR体系如下（50uL体系）： 10*Buffer 5UL MgCl2（50mM） 2uL 引物a（10uL） 1.5uL 引物b（10uL） 1.5uL dNTP（10mM） 1uL Taq酶（2U/uL） 1uL 模板 枪头蘸取一点菌 ddH2O 38uL ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 94度预变性5min 94度 45s 56度 45s 72度 90s 30个循环 问题到底出在哪里呢？我的退火温度从55-59度都试过，59度就没有条带了，引物从1、1.5、2uL的都试过，预变性时间从5、10、12min都试过，还试过把前一次PCR产物取1uL做模板，都有非特异性条带，为么捏？？？望大虾不吝赐教，小女先谢谢大家了~~ |
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