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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 通用引物扩增细菌16S rDNA
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zxjdawn

银虫 (小有名气)

[求助] 通用引物扩增细菌16S rDNA

我用通用引物扩增细菌16S rDNA，直接菌落PCR，我试了7、8次，每次都有700bp左右的的非特异性扩增，目的片段也有，在1500bp左右，我老师说他以前一做就出来了，根本没有非特异性扩增，为什么我每次都有呢，请各位虫友帮帮我~~~PCR体系如下（50uL体系）：
10*Buffer                            5UL
MgCl2（50mM）                 2uL
引物a（10uL）                   1.5uL
引物b（10uL）                   1.5uL
dNTP（10mM）                  1uL
Taq酶（2U/uL）                 1uL
模板                                    枪头蘸取一点菌
ddH2O                                38uL
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
94度预变性5min
94度          45s
56度          45s
72度          90s
30个循环
问题到底出在哪里呢？我的退火温度从55-59度都试过，59度就没有条带了，引物从1、1.5、2uL的都试过，预变性时间从5、10、12min都试过，还试过把前一次PCR产物取1uL做模板，都有非特异性条带，为么捏？？？望大虾不吝赐教，小女先谢谢大家了~~
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走自己的路，看身边的风景~~
1楼 2011-08-19 16:12:07
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
会不会是引物出现问题了，引物如果反复冻融的话有可能会裂解断裂。
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风雪夜归人
4楼2011-08-20 09:00:12
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ghost9106

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-08-19 18:18:42
zxjdawn(金币+1): 谢谢 2011-08-19 22:12:17
可能是菌没有完全裂解吧，试沸水浴或延长预变性时间。
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2楼2011-08-19 16:31:23
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zxjdawn

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ghost9106 at 2011-08-19 16:31:23:
可能是菌没有完全裂解吧，试沸水浴或延长预变性时间。

可是我试过预变性时间12min了，我觉得时间应该够长了吧。。。我还试过把菌挑到ddH2O里面，95度10min，再离心取上清做模板，结果还是一样，我就弄不明白问题到底出在哪里呢？？？？
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走自己的路，看身边的风景~~
3楼2011-08-19 22:15:20
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zxjdawn

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-20 09:00:12:
会不会是引物出现问题了，引物如果反复冻融的话有可能会裂解断裂。

可是引物是新合成的呢，，，我现在只能怀疑是引物序列出了问题，谢谢了~~~
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走自己的路，看身边的风景~~
5楼2011-08-20 09:36:00
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