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zxjdawn

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 1165600
注册: 2010-12-08
性别: MM
专业: 食品科学基础

[求助] 通用引物扩增细菌16S rDNA

我用通用引物扩增细菌16S rDNA，直接菌落PCR，我试了7、8次，每次都有700bp左右的的非特异性扩增，目的片段也有，在1500bp左右，我老师说他以前一做就出来了，根本没有非特异性扩增，为什么我每次都有呢，请各位虫友帮帮我~~~PCR体系如下（50uL体系）：
10*Buffer                         5UL
MgCl2（50mM）                2uL
引物a（10uL）                1.5uL
引物b（10uL）                1.5uL
dNTP（10mM）                1uL
Taq酶（2U/uL）                1uL
模板                                  枪头蘸取一点菌
ddH2O                               38uL
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
94度预变性5min
94度       45s
56度       45s
72度       90s
30个循环
问题到底出在哪里呢？我的退火温度从55-59度都试过，59度就没有条带了，引物从1、1.5、2uL的都试过，预变性时间从5、10、12min都试过，还试过把前一次PCR产物取1uL做模板，都有非特异性条带，为么捏？？？望大虾不吝赐教，小女先谢谢大家了~~

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走自己的路，看身边的风景~~

1楼 2011-08-19 16:12:07

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hzl5888

木虫 (小有名气)

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专业: 食品科学基础

★ ★ ★ ★
adslye(金币+2): 感谢交流，祝顺利！ 2011-08-22 08:56:18
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-08-22 12:34:53

引用回帖:

7楼: Originally posted by zxjdawn at 2011-08-20 10:27:03:
谢谢了，我本来是要鉴定乳杆菌，可是我也试过我自己分离到的解淀粉芽孢杆菌，结果没差异，两株菌都变异的可能性应该微乎其微吧。。。

如果菌株没有问题的话，建议在组分浓度上找找原因，因为我这里看不到你的引物浓度，会不会是引物浓度太高，如果引物的浓度很高产生引物二聚体的概率就比较高。也有可能是菌株不纯，还有可能是体系中出现了污染。虽然我没有做过你说的这个扩增，但是我做荧光定量时出现非特异性扩增都会从以上几方面找原因，我想既然都是PCR，原理都是一样的，分析原因应该也可以通用吧。希望能帮到你。