应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 通用引物扩增细菌16S rDNA
51/1返回列表
查看: 3397  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zxjdawn

银虫 (小有名气)

[求助] 通用引物扩增细菌16S rDNA

我用通用引物扩增细菌16S rDNA，直接菌落PCR，我试了7、8次，每次都有700bp左右的的非特异性扩增，目的片段也有，在1500bp左右，我老师说他以前一做就出来了，根本没有非特异性扩增，为什么我每次都有呢，请各位虫友帮帮我~~~PCR体系如下（50uL体系）：
10*Buffer                            5UL
MgCl2（50mM）                 2uL
引物a（10uL）                   1.5uL
引物b（10uL）                   1.5uL
dNTP（10mM）                  1uL
Taq酶（2U/uL）                 1uL
模板                                    枪头蘸取一点菌
ddH2O                                38uL
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
94度预变性5min
94度          45s
56度          45s
72度          90s
30个循环
问题到底出在哪里呢？我的退火温度从55-59度都试过，59度就没有条带了，引物从1、1.5、2uL的都试过，预变性时间从5、10、12min都试过，还试过把前一次PCR产物取1uL做模板，都有非特异性条带，为么捏？？？望大虾不吝赐教，小女先谢谢大家了~~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
走自己的路，看身边的风景~~
1楼 2011-08-19 16:12:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

j2

木虫 (正式写手)
★
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-21 09:44:11
为什么非要跑出一条带不可？直接切1500bp的胶回收就是了塞
通用引物在菌株基因的其他位置结合很正常吧~~~
赞一下(1人) 回复此楼
修炼ｉｎｇ，当虫仙……
8楼2011-08-20 13:06:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

ghost9106

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-08-19 18:18:42
zxjdawn(金币+1): 谢谢 2011-08-19 22:12:17
可能是菌没有完全裂解吧，试沸水浴或延长预变性时间。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-08-19 16:31:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zxjdawn

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ghost9106 at 2011-08-19 16:31:23:
可能是菌没有完全裂解吧，试沸水浴或延长预变性时间。

可是我试过预变性时间12min了，我觉得时间应该够长了吧。。。我还试过把菌挑到ddH2O里面，95度10min，再离心取上清做模板，结果还是一样，我就弄不明白问题到底出在哪里呢？？？？
赞一下 回复此楼
走自己的路，看身边的风景~~
3楼2011-08-19 22:15:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wqj1988926

金虫 (正式写手)
会不会是引物出现问题了，引物如果反复冻融的话有可能会裂解断裂。
赞一下 回复此楼
风雪夜归人
4楼2011-08-20 09:00:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 焦虑 +9 水冰月月野兔 2026-03-13 13/650 2026-03-19 09:50 by otani
[考研] 285化工学硕求调剂（081700） +11 柴郡猫_ 2026-03-12 11/550 2026-03-19 09:37 by laoshidan
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +9 SUICHILD 2026-03-12 9/450 2026-03-19 09:35 by 花店相见
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
[考研] 0703化学调剂 +8 妮妮ninicgb 2026-03-15 12/600 2026-03-19 05:55 by anny19840123
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +4 守候夕阳CF 2026-03-18 4/200 2026-03-18 22:16 by li123456789.
[考研] 085410人工智能专硕317求调剂（0854都可以） +3 xbxudjdn 2026-03-18 3/150 2026-03-18 22:14 by zhq0425
[考研] 一志愿中国海洋大学，生物学，301分，求调剂 +4 1孙悟空 2026-03-17 4/200 2026-03-18 17:59 by fivewind
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +8 Ncdx123456 2026-03-13 9/450 2026-03-18 14:40 by haxia
[考研] 268求调剂 +6 简单点0 2026-03-17 6/300 2026-03-18 09:04 by 无际的草原
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +4 张vvvv 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:15 by ruiyingmiao
[考研] 材料专硕326求调剂 +6 墨煜姒莘 2026-03-15 7/350 2026-03-17 17:10 by ruiyingmiao
[考研] 26考研求调剂 +6 丶宏Sir 2026-03-13 6/300 2026-03-17 16:13 by 醉在风里
[考研] 290求调剂 +6 孔志浩 2026-03-12 11/550 2026-03-17 14:41 by 周舟舟77
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +6 Losir 2026-03-12 7/350 2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +6 薛云鹏 2026-03-15 6/300 2026-03-17 11:05 by 学员h26Tkc
[考研] 321求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:33 by houyaoxu
[考研] 283求调剂 +10 小楼。 2026-03-12 14/700 2026-03-16 16:08 by 13811244083
[考博] 东华理工大学化材专业26届硕士博士申请 +6 zlingli 2026-03-13 6/300 2026-03-15 20:00 by ryzcf
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭