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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化后菌落PCR验证出现非特异性扩增
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天鸟

木虫 (正式写手)

[交流] 连接转化后菌落PCR验证出现非特异性扩增 已有4人参与

我的目的片段560bp，连接转化后，进行菌落PCR，出现非特异性扩增。如下图

在500-300bp之间有个条带，不知道是什么？我的载体是PMD 18-T，谢谢大家
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快乐生活，我快乐
1楼 2011-08-10 22:39:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+4): 就是这样！ 2011-08-11 11:59:38
有非特异性条带很正常，你可以再做一次，将退火温度提高看看，如果非特异性条带依然存在，只能说明你的引物特异性不是很好；

不过进行PCR验证连接只是一个初步筛选的一个过程，没有必要纠结这么多，下一步你可以将能够扩增出目的片段的那个菌进行质粒的提取，然后进行酶切验证，如果都没有什么问题，那么克隆就算做成功了，就可以进行下游工作了！

祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-08-11 09:17:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
信息给多点会好些。有没有做对照？这对引物P其他模板有这个条带嘛？
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2楼2011-08-10 23:08:14
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 菌落PCR确实经常有杂带。 2011-08-10 23:22:19
我用M13引物做T载体菌落PCR验证，也出现过非特异性条带。
菌落PCR有非特异性条带，我都当是正常现象的。如果提质粒PCR还是有非特异性条带就不太正常了，一般都是送测的。
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3楼2011-08-10 23:16:15
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): good 2011-08-11 11:59:17
正常，细菌基因组没准有同源区哦。
挑几个菌，提质粒，做下酶切。
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4楼2011-08-11 06:28:32
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