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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体的构建
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 表达载体的构建 已有6人参与

本人已将目的片段载体亚克隆至克隆载体pMD19-T（Simple）载体中，现在要构建表达载体，用限制性内切酶将目的片段从克隆载体上切下，20微升的酶切体系中加10微升的质粒。遇到一个问题就是双酶切后克隆载体片段挺亮的，但目的片段非常的淡（目的片段较小，285bp），这样会不会影响后面的连接反应啊？我看网上说要保证连接的成功，目的片段和载体的浓度最好都大一些。如果做PCR然后酶切PCR产物的话，又存在扩增过程中可能出现突变或者是无法判断是否酶切完全。请各位高手指点一下啊！

图片信息说明，Mark：200、500、800、1200、2000、3000、4500
第一张图，除Mark外左数第一第二泳道分别为NcoI单酶切pET32a和BamHI单酶切pET32a，第三泳道为上述两酶双酶切pET32a，第四泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体；均是20微升体系，质粒10微升，酶各自1微升，切3h。

第二张图，第一第二泳道NcoI和BamHI分别单酶切pET32a，第三泳道Mark，第四泳道双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体（质粒为公司测序后返还的质粒），切4h，第五泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体后切胶回收的目的片段，切了3管，每管20微升的体系，10微升的质粒。

第三张图，除Mark外左数第一和第二泳道为双酶切双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体，第三泳道为未酶切的带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体。切了4h。

大家帮我看看，pET32a载体3h和4h双酶切切开了没？目的片段的量做连接是不是太少了？有没有什么好的建议啊！






[ Last edited by friya0910 on 2011-8-11 at 09:22 ]
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1楼 2011-08-10 19:32:32
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-08-10 20:13:39
内容已删除
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-08-10 19:45:32
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xbl3688

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我用的连接体系中，目的片段与载体的体积比是7:1，这样就好一些。你的载体是高表达载体吗？
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
3楼2011-08-10 20:27:55
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
1：楼主的目的片段285bp，确实太小了，20ul体系添加10ul重组载体，然后进行酶切，当然是可以酶切开的，但是你的目的片段由于太小了，所以导致出来的质量太小而很淡，这样做链接的话成功的概率确实很低；何不扩大你的酶切体系至50ul或者更多，然后多添加一些酶，多切一会，然后跑个电泳，做一个切胶纯化，然后再跑电泳定量一下，做一个连接，这样成功概率会大很多；
2：当然了，我还是建议你直接用原来基因的引物做一个PCR，然后纯化，酶切，再纯化，然后进行连接，这样也是很快的，而且成功率也比较高的！

祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-08-10 20:50:11
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-10 19:45:32:
目的片段的亮度是载体的1/N(N代表载体与目的片段的分子量之比)，再加上你的片段比较小，所以你下次酶切的时候请多切些质粒。或者你把重组质粒的跑胶图片给我，我给你推荐个酶切体系。最好是切下来去连表达载体，原 ...

今天跑了个图，现在电脑关了，明天传上来啊！
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5楼2011-08-10 21:13:54
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-08-10 20:27:55:
我用的连接体系中，目的片段与载体的体积比是7:1，这样就好一些。你的载体是高表达载体吗？

我用的表达载体是pET32a
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6楼2011-08-10 21:14:28
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-10 20:50:11:
1：楼主的目的片段285bp，确实太小了，20ul体系添加10ul重组载体，然后进行酶切，当然是可以酶切开的，但是你的目的片段由于太小了，所以导致出来的质量太小而很淡，这样做链接的话成功的概率确实很低；何不扩大你 ...

因为我用的TaKaRa的内切酶的推荐体系是20微升，我打电话到公司咨询，他们的技术人员说最好用20微升体系切，我打算切3管，然后一起回收，这样不就相当于做了60微升的体系吗？但是切胶回收的带还不是很亮！
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7楼2011-08-10 21:17:55
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ytf149

新虫 (小有名气)
多切一些吧~
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加油~
8楼2011-08-10 23:49:36
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imfly77

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+4): Good！很有经验！ 2011-08-11 11:54:59
引用回帖:
7楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-10 21:17:55:
因为我用的TaKaRa的内切酶的推荐体系是20微升，我打电话到公司咨询，他们的技术人员说最好用20微升体系切，我打算切3管，然后一起回收，这样不就相当于做了60微升的体系吗？但是切胶回收的带还不是很亮！

双酶切很容易做的。。。直接切一个100微升体系没有问题，但是浪费质粒啊。
（说实话，公司那种技术人员很多都是胡说八道。）
如果片段小于500bp，一般来说还是用PCR比较好，基本上不会有突变，50 ul体系能得到大概8-10 ug左右的目的基因。
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9楼2011-08-11 09:17:28
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 09:17:28:
双酶切很容易做的。。。直接切一个100微升体系没有问题，但是浪费质粒啊。
（说实话，公司那种技术人员很多都是胡说八道。）
如果片段小于500bp，一般来说还是用PCR比较好，基本上不会有突变，50 ul体系能得到 ...

那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？
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10楼2011-08-11 09:29:39
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