| 查看: 2799 | 回复: 17 | |||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
friya0910新虫 (正式写手)
|
[交流]
表达载体的构建 已有6人参与
|
||||
|
本人已将目的片段载体亚克隆至克隆载体pMD19-T（Simple）载体中，现在要构建表达载体，用限制性内切酶将目的片段从克隆载体上切下，20微升的酶切体系中加10微升的质粒。遇到一个问题就是双酶切后克隆载体片段挺亮的，但目的片段非常的淡（目的片段较小，285bp），这样会不会影响后面的连接反应啊？我看网上说要保证连接的成功，目的片段和载体的浓度最好都大一些。如果做PCR然后酶切PCR产物的话，又存在扩增过程中可能出现突变或者是无法判断是否酶切完全。请各位高手指点一下啊！ 图片信息说明，Mark：200、500、800、1200、2000、3000、4500 第一张图，除Mark外左数第一第二泳道分别为NcoI单酶切pET32a和BamHI单酶切pET32a，第三泳道为上述两酶双酶切pET32a，第四泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体；均是20微升体系，质粒10微升，酶各自1微升，切3h。 第二张图，第一第二泳道NcoI和BamHI分别单酶切pET32a，第三泳道Mark，第四泳道双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体（质粒为公司测序后返还的质粒），切4h，第五泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体后切胶回收的目的片段，切了3管，每管20微升的体系，10微升的质粒。 第三张图，除Mark外左数第一和第二泳道为双酶切双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体，第三泳道为未酶切的带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体。切了4h。 大家帮我看看，pET32a载体3h和4h双酶切切开了没？目的片段的量做连接是不是太少了？有没有什么好的建议啊！    [ Last edited by friya0910 on 2011-8-11 at 09:22 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有100人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复
- 关于农杆菌单菌株/双质粒表达载体的构建问题
已经有14人回复
- 求真菌表达载体pBARGPE1的酶切方法！！！
已经有11人回复
- 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
已经有31人回复
- 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂
已经有12人回复
- 寻找DsbA\B\C\D中的任何一个或多个。用以构建共表达载体。
已经有3人回复
- 关于SiRNA表达载体构建的问题
已经有9人回复
- 表达载体构建的相关问题
已经有15人回复
- 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
已经有8人回复
- 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
已经有5人回复
- 【求助/交流】酵母表达和原核表达，在技术上有什么不同？
已经有6人回复
- 【求助/交流】拟改造一个表达载体，请大家帮忙分析下如何进行
已经有3人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因
已经有27人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
friya0910
新虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在线: 77.4小时
- 虫号: 1073675
- 注册: 2010-08-12
- 专业: 作物分子育种
10楼2011-08-11 09:29:39
xbl3688
银虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 1240.1
- 红花: 1
- 帖子: 311
- 在线: 104.7小时
- 虫号: 1348397
- 注册: 2011-07-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2011-08-10 20:27:55
天使托
专家顾问 (职业作家)
T.Shen
-
专家经验: +57 - MolEPI: 106
- 应助: 95 (初中生)
- 贵宾: 0.263
- 金币: 16332.8
- 散金: 593
- 红花: 74
- 沙发: 9
- 帖子: 3652
- 在线: 289小时
- 虫号: 441757
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 微生物生理与生物化学
- 管辖: 微生物
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
|
1：楼主的目的片段285bp，确实太小了，20ul体系添加10ul重组载体，然后进行酶切，当然是可以酶切开的，但是你的目的片段由于太小了，所以导致出来的质量太小而很淡，这样做链接的话成功的概率确实很低；何不扩大你的酶切体系至50ul或者更多，然后多添加一些酶，多切一会，然后跑个电泳，做一个切胶纯化，然后再跑电泳定量一下，做一个连接，这样成功概率会大很多； 2：当然了，我还是建议你直接用原来基因的引物做一个PCR，然后纯化，酶切，再纯化，然后进行连接，这样也是很快的，而且成功率也比较高的！ 祝好运！ |
4楼2011-08-10 20:50:11
friya0910
新虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在线: 77.4小时
- 虫号: 1073675
- 注册: 2010-08-12
- 专业: 作物分子育种
5楼2011-08-10 21:13:54
