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friya0910新虫 (正式写手)
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[交流]
表达载体的构建 已有6人参与
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本人已将目的片段载体亚克隆至克隆载体pMD19-T（Simple）载体中，现在要构建表达载体，用限制性内切酶将目的片段从克隆载体上切下，20微升的酶切体系中加10微升的质粒。遇到一个问题就是双酶切后克隆载体片段挺亮的，但目的片段非常的淡（目的片段较小，285bp），这样会不会影响后面的连接反应啊？我看网上说要保证连接的成功，目的片段和载体的浓度最好都大一些。如果做PCR然后酶切PCR产物的话，又存在扩增过程中可能出现突变或者是无法判断是否酶切完全。请各位高手指点一下啊！ 图片信息说明，Mark：200、500、800、1200、2000、3000、4500 第一张图，除Mark外左数第一第二泳道分别为NcoI单酶切pET32a和BamHI单酶切pET32a，第三泳道为上述两酶双酶切pET32a，第四泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体；均是20微升体系，质粒10微升，酶各自1微升，切3h。 第二张图，第一第二泳道NcoI和BamHI分别单酶切pET32a，第三泳道Mark，第四泳道双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体（质粒为公司测序后返还的质粒），切4h，第五泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体后切胶回收的目的片段，切了3管，每管20微升的体系，10微升的质粒。 第三张图，除Mark外左数第一和第二泳道为双酶切双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体，第三泳道为未酶切的带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体。切了4h。 大家帮我看看，pET32a载体3h和4h双酶切切开了没？目的片段的量做连接是不是太少了？有没有什么好的建议啊！    [ Last edited by friya0910 on 2011-8-11 at 09:22 ] |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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friya0910
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
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1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
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1：楼主的目的片段285bp，确实太小了，20ul体系添加10ul重组载体，然后进行酶切，当然是可以酶切开的，但是你的目的片段由于太小了，所以导致出来的质量太小而很淡，这样做链接的话成功的概率确实很低；何不扩大你的酶切体系至50ul或者更多，然后多添加一些酶，多切一会，然后跑个电泳，做一个切胶纯化，然后再跑电泳定量一下，做一个连接，这样成功概率会大很多； 2：当然了，我还是建议你直接用原来基因的引物做一个PCR，然后纯化，酶切，再纯化，然后进行连接，这样也是很快的，而且成功率也比较高的！ 祝好运！ |
4楼2011-08-10 20:50:11
friya0910
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5楼2011-08-10 21:13:54
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