24小时热门版块排行榜

返回列表

本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

friya0910

新虫 (正式写手)

应助: 4 (幼儿园)
金币: 19.4
散金: 360
帖子: 401
在线: 77.4小时
虫号: 1073675
注册: 2010-08-12
专业: 作物分子育种

[交流] 表达载体的构建已有6人参与

本人已将目的片段载体亚克隆至克隆载体pMD19-T（Simple）载体中，现在要构建表达载体，用限制性内切酶将目的片段从克隆载体上切下，20微升的酶切体系中加10微升的质粒。遇到一个问题就是双酶切后克隆载体片段挺亮的，但目的片段非常的淡（目的片段较小，285bp），这样会不会影响后面的连接反应啊？我看网上说要保证连接的成功，目的片段和载体的浓度最好都大一些。如果做PCR然后酶切PCR产物的话，又存在扩增过程中可能出现突变或者是无法判断是否酶切完全。请各位高手指点一下啊！

图片信息说明，Mark：200、500、800、1200、2000、3000、4500
第一张图，除Mark外左数第一第二泳道分别为NcoI单酶切pET32a和BamHI单酶切pET32a，第三泳道为上述两酶双酶切pET32a，第四泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体；均是20微升体系，质粒10微升，酶各自1微升，切3h。

第二张图，第一第二泳道NcoI和BamHI分别单酶切pET32a，第三泳道Mark，第四泳道双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体（质粒为公司测序后返还的质粒），切4h，第五泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体后切胶回收的目的片段，切了3管，每管20微升的体系，10微升的质粒。

第三张图，除Mark外左数第一和第二泳道为双酶切双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体，第三泳道为未酶切的带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体。切了4h。

大家帮我看看，pET32a载体3h和4h双酶切切开了没？目的片段的量做连接是不是太少了？有没有什么好的建议啊！

[ Last edited by friya0910 on 2011-8-11 at 09:22 ]

回复此楼