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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体的构建
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imfly77

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): Good 2011-08-11 11:58:06
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10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 09:29:39:
那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？

（1）如果为了克隆的目的，PCR都需要用高保真酶。如果片段短的话，一般的比如rTaq和exTaq问题也不大——这都是看人品的事。但还是建议至少买几种高保真酶，或者去隔壁实验室借。

（2）50 ul体系加2 ng左右质粒模板就够了，具体的体系可以看看DNA聚合酶的说明。
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11楼2011-08-11 09:47:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 09:29:39:
那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？

片段少于1kb的，我以前用普通的taq都可以。
如果质粒浓度高的话，用0.2～0.5ul都足够了，实在不放心可以加1ul。lucky～
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你的日子如何，你的力量也必如何！
12楼2011-08-11 10:20:30
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 09:47:26:
（1）如果为了克隆的目的，PCR都需要用高保真酶。如果片段短的话，一般的比如rTaq和exTaq问题也不大——这都是看人品的事。但还是建议至少买几种高保真酶，或者去隔壁实验室借。

（2）50 ul体系加2 ng左右质粒 ...

我有TaKaRa的LA Taq，不知道可以不可以？
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13楼2011-08-11 10:25:51
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imfly77

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2, MolEPI+1): 连上面几个回帖一起授予MolEPI 2011-08-11 11:58:52
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13楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 10:25:51:
我有TaKaRa的LA Taq，不知道可以不可以？

可以。另外LA Taq一般都是用在高GT基因的扩增，对通常的PCR用的不多，不过对你这个体系应该是没问题的。——就一个小PCR而已，没必要纠结啦。

btw：推荐去买点Transgen的fast pfu吧，那个酶挺好用的。
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14楼2011-08-11 10:39:28
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 10:39:28:
可以。另外LA Taq一般都是用在高GT基因的扩增，对通常的PCR用的不多，不过对你这个体系应该是没问题的。——就一个小PCR而已，没必要纠结啦。

btw：推荐去买点Transgen的fast pfu吧，那个酶挺好用的。

谢谢指导啊！我今天先切5管，然后切胶看一下，如果目的片段还是太淡的话我再考虑做PCR，可是我就怕用PCR的话酶切的时候不太好判断目的片段是否酶切完全啊，如果双酶切PCR产物的话一般都切多长时间的呀？
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imfly77
15楼2011-08-11 10:43:04
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imfly77

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
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15楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 10:43:04:
谢谢指导啊！我今天先切5管，然后切胶看一下，如果目的片段还是太淡的话我再考虑做PCR，可是我就怕用PCR的话酶切的时候不太好判断目的片段是否酶切完全啊，如果双酶切PCR产物的话一般都切多长时间的呀？

（1）酶切的话不用做5管那么麻烦，直接1管100ul就行够了，体系按比例扩大。
（2）双酶切反应速度看酶，我以前用NEB的酶一般是切2-12个小时左右，得看是不是着急了。据说NEB也有快速内切酶，切十几分钟就行，因为没用过所以不好说。
（3）PCR产物切干净与否不会太影响后续的克隆——因为只有切开的能连上去。
但载体的话就一定要尽可能切干净了。

这方面的实验细节尽可能问师兄们吧。
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16楼2011-08-11 15:00:35
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xbl3688

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 09:29:39:
那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？

我们做25ul的PCR体系，模板加20ul
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
17楼2011-08-11 17:00:31
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 15:00:35:
（1）酶切的话不用做5管那么麻烦，直接1管100ul就行够了，体系按比例扩大。
（2）双酶切反应速度看酶，我以前用NEB的酶一般是切2-12个小时左右，得看是不是着急了。据说NEB也有快速内切酶，切十几分钟就行，因为 ...

悲惨的是我没有师兄可以问啊，我是我们这第一个做分子的，老师也不怎么懂！所以只能来这儿求助高人们了！
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18楼2011-08-11 20:02:09
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