应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体的构建
182/2返回列表上一页12
查看: 3600  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

imfly77

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): Good 2011-08-11 11:58:06
引用回帖:
10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 09:29:39:
那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？

（1）如果为了克隆的目的，PCR都需要用高保真酶。如果片段短的话，一般的比如rTaq和exTaq问题也不大——这都是看人品的事。但还是建议至少买几种高保真酶，或者去隔壁实验室借。

（2）50 ul体系加2 ng左右质粒模板就够了，具体的体系可以看看DNA聚合酶的说明。
赞一下(2人) 回复此楼
11楼2011-08-11 09:47:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 09:29:39:
那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？

片段少于1kb的，我以前用普通的taq都可以。
如果质粒浓度高的话，用0.2～0.5ul都足够了，实在不放心可以加1ul。lucky～
赞一下(1人) 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
12楼2011-08-11 10:20:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 09:47:26:
（1）如果为了克隆的目的，PCR都需要用高保真酶。如果片段短的话，一般的比如rTaq和exTaq问题也不大——这都是看人品的事。但还是建议至少买几种高保真酶，或者去隔壁实验室借。

（2）50 ul体系加2 ng左右质粒 ...

我有TaKaRa的LA Taq，不知道可以不可以？
赞一下 回复此楼
13楼2011-08-11 10:25:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

imfly77

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2, MolEPI+1): 连上面几个回帖一起授予MolEPI 2011-08-11 11:58:52
引用回帖:
13楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 10:25:51:
我有TaKaRa的LA Taq，不知道可以不可以？

可以。另外LA Taq一般都是用在高GT基因的扩增，对通常的PCR用的不多，不过对你这个体系应该是没问题的。——就一个小PCR而已，没必要纠结啦。

btw：推荐去买点Transgen的fast pfu吧，那个酶挺好用的。
赞一下(2人) 回复此楼
14楼2011-08-11 10:39:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 10:39:28:
可以。另外LA Taq一般都是用在高GT基因的扩增，对通常的PCR用的不多，不过对你这个体系应该是没问题的。——就一个小PCR而已，没必要纠结啦。

btw：推荐去买点Transgen的fast pfu吧，那个酶挺好用的。

谢谢指导啊！我今天先切5管，然后切胶看一下，如果目的片段还是太淡的话我再考虑做PCR，可是我就怕用PCR的话酶切的时候不太好判断目的片段是否酶切完全啊，如果双酶切PCR产物的话一般都切多长时间的呀？
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

imfly77
15楼2011-08-11 10:43:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

imfly77

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 10:43:04:
谢谢指导啊！我今天先切5管，然后切胶看一下，如果目的片段还是太淡的话我再考虑做PCR，可是我就怕用PCR的话酶切的时候不太好判断目的片段是否酶切完全啊，如果双酶切PCR产物的话一般都切多长时间的呀？

（1）酶切的话不用做5管那么麻烦，直接1管100ul就行够了，体系按比例扩大。
（2）双酶切反应速度看酶，我以前用NEB的酶一般是切2-12个小时左右，得看是不是着急了。据说NEB也有快速内切酶，切十几分钟就行，因为没用过所以不好说。
（3）PCR产物切干净与否不会太影响后续的克隆——因为只有切开的能连上去。
但载体的话就一定要尽可能切干净了。

这方面的实验细节尽可能问师兄们吧。
赞一下(1人) 回复此楼
16楼2011-08-11 15:00:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xbl3688

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-11 09:29:39:
那PCR需要用高保真酶吗？我没有高保真酶，一般的可以吗？如果做PCR的话是不是用质粒做模板就可以啊？那50微升体系一般加多少模板量啊？

我们做25ul的PCR体系，模板加20ul
赞一下(1人) 回复此楼
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
17楼2011-08-11 17:00:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by imfly77 at 2011-08-11 15:00:35:
（1）酶切的话不用做5管那么麻烦，直接1管100ul就行够了，体系按比例扩大。
（2）双酶切反应速度看酶，我以前用NEB的酶一般是切2-12个小时左右，得看是不是着急了。据说NEB也有快速内切酶，切十几分钟就行，因为 ...

悲惨的是我没有师兄可以问啊，我是我们这第一个做分子的，老师也不怎么懂！所以只能来这儿求助高人们了！
赞一下 回复此楼
18楼2011-08-11 20:02:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 friya0910 的主题更新
182/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-11 01:24 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 6/300 2026-11-11 01:21 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 6/300 2026-11-11 01:13 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 5/250 2026-11-11 01:04 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 5/250 2026-11-11 00:53 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 21:02 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:56 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:45 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:07 by Z7qfCsdIiD1T
[考博] 申请环境，微生物方向博士 +3 浅笑09 2026-11-08 3/150 2026-11-10 12:44 by 可淡不可忘
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 5/250 2026-11-09 16:53 by 张丹枫1991
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 15/750 2026-11-09 11:41 by GwrQVVR6Oenx
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 22:46 by l48hFd8Nwae2
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭