| 查看: 3446 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
friya0910新虫 (正式写手)
|
[交流]
表达载体的构建 已有6人参与
|
|||
|
本人已将目的片段载体亚克隆至克隆载体pMD19-T（Simple）载体中，现在要构建表达载体，用限制性内切酶将目的片段从克隆载体上切下，20微升的酶切体系中加10微升的质粒。遇到一个问题就是双酶切后克隆载体片段挺亮的，但目的片段非常的淡（目的片段较小，285bp），这样会不会影响后面的连接反应啊？我看网上说要保证连接的成功，目的片段和载体的浓度最好都大一些。如果做PCR然后酶切PCR产物的话，又存在扩增过程中可能出现突变或者是无法判断是否酶切完全。请各位高手指点一下啊！ 图片信息说明，Mark：200、500、800、1200、2000、3000、4500 第一张图，除Mark外左数第一第二泳道分别为NcoI单酶切pET32a和BamHI单酶切pET32a，第三泳道为上述两酶双酶切pET32a，第四泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体；均是20微升体系，质粒10微升，酶各自1微升，切3h。 第二张图，第一第二泳道NcoI和BamHI分别单酶切pET32a，第三泳道Mark，第四泳道双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体（质粒为公司测序后返还的质粒），切4h，第五泳道为双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体后切胶回收的目的片段，切了3管，每管20微升的体系，10微升的质粒。 第三张图，除Mark外左数第一和第二泳道为双酶切双酶切带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体，第三泳道为未酶切的带有目的片段的pMD19-T（Simple）载体。切了4h。 大家帮我看看，pET32a载体3h和4h双酶切切开了没？目的片段的量做连接是不是太少了？有没有什么好的建议啊！    [ Last edited by friya0910 on 2011-8-11 at 09:22 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有178人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
-
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
imfly77
木虫 (小有名气)
- MolEPI: 6
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 3065.8
- 散金: 234
- 红花: 2
- 帖子: 287
- 在线: 151.3小时
- 虫号: 1324638
- 注册: 2011-06-16
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
送鲜花一朵 
16楼2011-08-11 15:00:35
xbl3688
银虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 1240.1
- 红花: 1
- 帖子: 311
- 在线: 104.7小时
- 虫号: 1348397
- 注册: 2011-07-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2011-08-10 20:27:55
天使托
专家顾问 (职业作家)
T.Shen
-
专家经验: +57 - MolEPI: 106
- 应助: 95 (初中生)
- 贵宾: 0.263
- 金币: 16293.3
- 散金: 593
- 红花: 74
- 沙发: 9
- 帖子: 3661
- 在线: 291小时
- 虫号: 441757
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 微生物生理与生物化学
- 管辖: 微生物
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(MolEPI+1): 天使大哥 要epi好办啊 2011-08-10 20:51:51
|
1：楼主的目的片段285bp，确实太小了，20ul体系添加10ul重组载体，然后进行酶切，当然是可以酶切开的，但是你的目的片段由于太小了，所以导致出来的质量太小而很淡，这样做链接的话成功的概率确实很低；何不扩大你的酶切体系至50ul或者更多，然后多添加一些酶，多切一会，然后跑个电泳，做一个切胶纯化，然后再跑电泳定量一下，做一个连接，这样成功概率会大很多； 2：当然了，我还是建议你直接用原来基因的引物做一个PCR，然后纯化，酶切，再纯化，然后进行连接，这样也是很快的，而且成功率也比较高的！ 祝好运！ |
4楼2011-08-10 20:50:11
friya0910
新虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 19.4
- 散金: 360
- 帖子: 401
- 在线: 77.4小时
- 虫号: 1073675
- 注册: 2010-08-12
- 专业: 作物分子育种
5楼2011-08-10 21:13:54
