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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何进一步纯化这个蛋白？
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blueghost006

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何进一步纯化这个蛋白？

最近在纯化一个蛋白~~但是总是会有杂带啊~~~~不知道有什么方法可以将那些讨厌的杂带给弄掉~~~~另外，我纯化出来去打抗体的~~~不知道就以这样的水平可以打么？PS：最亮的是我的目的条带~~~~
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1楼 2011-07-16 10:29:06
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zhougama

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2011-07-16 15:00:04
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以利用TAP技术进行蛋白纯化，你搜下网上很多介绍的
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3楼2011-07-16 15:52:36
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blueghost006

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhougama at 2011-07-16 15:00:04:
你总得简单介绍下你的纯化方法以及你这种蛋白质的某些性质吧，不然我们如何知道！

我的那个蛋白是一个全蛋白的N端，与Trx融合，PET32作为载体，在BL21中表达，然后过Ni柱，先用6M~1M的尿素复性，然后用咪唑洗脱，先用20mM的PH=7.5的咪唑洗脱，再用20mM/PH=6.0咪唑洗脱，最后用500mM/PH=8.0的咪唑洗下目的蛋白，不知道各位大虾有什么意见？
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4楼2011-07-17 13:27:39
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zhougama

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2011-07-17 16:33:55
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-17 19:11:45
镍柱虽然说也是亲和层析，但是宿主菌可能有的蛋白质里的组氨酸是连着有两个或者3个的，也可以被吸附。你的洗脱梯度pH值变来变去的，结果通过改变pH值的方法不能达到纯化，那就试一下改变咪唑梯度。一般来说20毫摩尔是洗去完全不能结合的蛋白质，后面可以用50、100、150、200、250，这些梯度可以逐渐把非目的蛋白质洗去。在这个过程中可能有两个或者3个梯度都有目的蛋白质被洗脱，但是其中有一个梯度是目的蛋白质最多的，在这些梯度中，可能有一个梯度含有杂带最少。最后的500毫摩尔是把蛋白质全都洗掉的，可以保留这个梯度。

你先试一下咪唑梯度，应该会有更纯的蛋白质，但是如果用来做抗原就要更加纯了，你现在的纯度是不可能的。

如果还不纯就再试一下其它纯化方法，例如离子交换层析和疏水层析。如果还不行，盐析和有机溶剂沉淀也可以考虑一下，不过就稍微麻烦些。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2011-07-17 17:32:34
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-07-17 20:47:43
镍柱效果再差，也不是这个纯度啊。
镍柱最好不用ph梯度。
用咪唑梯度来洗会好得多。
我的经验，一般25-50mM的浓度可以把90%以上的杂带去掉。
你可以用25mM咪唑洗一下，50mM咪唑洗一下，然后直接500mM咪唑洗。
ph恒定不变。
绝对没问题。
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生物资源交流QQ群：1044518333
7楼2011-07-17 19:13:33
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是你的蛋白既有聚集又有降解啊？你跑sds胶上样buffer里有dtt吗？
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8楼2013-05-23 09:44:50
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