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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教real time pcr问题，谢谢！
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billy8580

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教real time pcr问题，谢谢！

各位大虾们，小弟想咨询一些荧光定量的问题，如下：
1. RNA提取后，必须要测浓度吗，要根据浓度来决定加入多少ul的rna吗？
2. 假如cDNA中还有DNA污染，该怎么办？能在cDNA中加入DNAseI除去DNA吗，这回切割cDNA吗？
3. 我的模板稀释了四个梯度（5,25,125,625）选用18s做内参，结果CT值很大，都在30以上，后来调整了预变性时间，从5min增加到10min，CT值降为24左右，但是这对于内参基因来讲，仍然很大。我的目的基因CT值都在32-33以上。请问这是怎么回事？我的RNA用盒子提的，效果不错。反转录用的promega的m-mlv，用ologodt15（50uM）做引物。
4. 我有个同学做逆境，相同稀释倍数时，干旱处理时内参18S的CT在10左右，但做盐胁迫时相同18S的CT值竟然都在25左右，后来测了一下模板浓度， 都在1000-1300ng左右，感觉差不多呀，听一个师姐说做不同的逆境，可能需要不同的引物，请问这是怎么回事呢？

小弟最近一直很迷茫，不敢轻易再上ABI7500去尝试了，因为材料有限，模板有限，不敢轻易得瑟模板。请各位大虾给予解答！谢谢！
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1楼2011-07-07 00:40:53
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浮生、若梦

金虫 (小有名气)
十分感谢西瓜斑竹，学到不少东西！
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坚持自我
10楼2013-05-03 11:55:16
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 赶快续，EPI等着你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金币+1): 不错，分析的详细 2011-07-10 00:40:53
1.需要测浓度的，理由：（1）不同的样品，用的RNA量一样（cDNA量也一样），定量结果更可靠。虽然内参可以校正样品量的差异，但是起始RNA量一样的话，结果更可靠，也更漂亮（理想情况是各个不同样品内参的Ct值非常接近）；（2）反转录酶能力不是无限的，说明书上都有说RNA的最大加入量，所以需要预先知道RNA浓度；（3）保证实验的可重复性。

2.DNA酶也会降解cDNA。不过可以用DNA酶处理RNA，之后灭活DNA酶（一般就是酚氯仿抽提），再做反转录。但是这样RNA的量损失很大，你样品少的话不推荐这样。当然通过引物设计，跨内含子，可以避免基因组DNA的扩增，不过引物有时候很难设计。最好的办法，还是好好提你的RNA，特别是加氯仿抽提之后取上清时，不要贪多，这样就能避免基因组DNA的污染了。再说了，你用试剂盒提的，如果还有基因组DNA污染，那就是操作不当啦。你样品宝贵，可以用其他材料，专门练练RNA提取。

（老婆逼睡觉，未完待续）
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2楼2011-07-07 02:13:23
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-07-07 18:30:50
3. Ct值跟预变性时间关系不大。你的情况是模板浓度太低了。连稀释5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次测了RNA浓度，然后按照反转录试剂盒允许使用的RNA最大量来做反转录。之后梯度稀释（一般10倍一个梯度）再做荧光定量PCR。这个算是预实验，要解决的问题是模板该用多少ul。

4.如果内参随处理不同而变化的话，那不是个好内参啊。好的内参基因，不管如何处理，只要模板量一样，它的Ct值就应该差不多。不知道你师姐说的用不同引物是不是指用不同的内参基因，这方面还是问问你师姐吧。可以做内参的基因很多，actin、GAPDH、tublin等等，如果18s确实有这样的变化，建议你还是查查文献，换其他内参。

一家之言，仅供参考，欢迎各位同行指正哈
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3楼2011-07-07 09:28:59
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倔强的投手

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-07 18:30:59
1.最还把RNA稀释到一个浓度，然后做反转录，尽力把所有的条件都统一到一个水平，这样做出来的结果会更可靠
2.做定量的时候确实要考虑基因组DNA污染的问题，如果你不想取出gDNA的话，那就在设计引物上下功夫，引物跨内含子的话，就可以排除gDNA的影响。或者，可以再反转录前取出基因组DNA，Takara公司有这种反转录试剂盒，在RT之前加一步gDNA去除的步骤，效果还可以，我就是用的这个试剂盒，挺好的。
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4楼2011-07-07 16:17:54
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