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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教real time pcr问题，谢谢！
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billy8580

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教real time pcr问题，谢谢！

各位大虾们，小弟想咨询一些荧光定量的问题，如下：
1. RNA提取后，必须要测浓度吗，要根据浓度来决定加入多少ul的rna吗？
2. 假如cDNA中还有DNA污染，该怎么办？能在cDNA中加入DNAseI除去DNA吗，这回切割cDNA吗？
3. 我的模板稀释了四个梯度（5,25,125,625）选用18s做内参，结果CT值很大，都在30以上，后来调整了预变性时间，从5min增加到10min，CT值降为24左右，但是这对于内参基因来讲，仍然很大。我的目的基因CT值都在32-33以上。请问这是怎么回事？我的RNA用盒子提的，效果不错。反转录用的promega的m-mlv，用ologodt15（50uM）做引物。
4. 我有个同学做逆境，相同稀释倍数时，干旱处理时内参18S的CT在10左右，但做盐胁迫时相同18S的CT值竟然都在25左右，后来测了一下模板浓度， 都在1000-1300ng左右，感觉差不多呀，听一个师姐说做不同的逆境，可能需要不同的引物，请问这是怎么回事呢？

小弟最近一直很迷茫，不敢轻易再上ABI7500去尝试了，因为材料有限，模板有限，不敢轻易得瑟模板。请各位大虾给予解答！谢谢！
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1楼2011-07-07 00:40:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): 够热心够辛苦 2011-07-09 08:03:44
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-07-07 18:46:39:
您好，我也顺便请教一下，我做的是原核生物的相对定量，内参基因不是就为了消除不同模板浓度带来的差异吗？那为什么还有调整RNA的浓度呢?我做和很多了，马上要写文章，但是没有调整其浓度到一致的水平，听你这 ...

您说得没错，内参基因就是为了消除模板量差异的，不过调整到同样的浓度，扩增曲线会更好看（内参基因的曲线几乎重合）。而且还有一个作用，那就是检验这次PCR是否可靠：模板量一样的话，理论上内参基因的Ct值应该都差不多，如果出现Ct值偏差很大的情况，那就有问题了。

我有一次摸索某样品的荧光定量PCR条件，实验室以前没人做过（注明：我是直接用的基因组DNA进行定量）。第一次做，内参基因的Ct值差异很大（用同样量的DNA），后面改进了样品DNA的提取方法，之后不同样品间内参基因的Ct值就很一致了。可能前面步骤导致了DNA的损失，或是有PCR反应的抑制剂吧。
试想假如我当时模板量用的不是一样的，那我就不能发现DNA提取方法需要改进，那么我得到的结果就很值得怀疑了。

我见过有实验室要求他们的学生，不同内参基因的Ct必须做到一致（SD<0.2还是多少），挺变态的，我师兄去他们那做实验都被折磨疯了：不断调样品浓度，但总也没法让内参Ct值的差异符合要求……一般实验室都只要求模板量用一样的即可，内参基因Ct值不要差太多，这种结果就接受了。像前面提到的实验室那样，通过调整模板浓度来使得内参一致，我觉得倒挺有造假嫌疑的。

您的情况，我觉得看您是否对自己的结果有自信了。我具的自己的例子，是一个特例：提取步骤里有能抑制酶活的成分，故Ct值差异引起了我对提取步骤的怀疑（毕竟是自己摸索，想得比较多）。如果您的一整套方法都很成熟了，那么内参出问题的可能性就很小，这样的结果是可靠的。毕竟，当初引入内参，为的就是消除模板量的差异，内参没出问题，那么模板量用的不一样也没关系。
前面那个“变态”的实验室，他们发表的结果里需要有扩增曲线的图，不得不把图做得“漂亮”些。您的情况，我估计就放上最终定量的结果就可以了吧？不是专门研究定量技术的倒是没必要把扩增曲线图和Ct值这些放上去，那么内参Ct值有点差异倒不会影响文章发表。

其实，荧光定量PCR是一个精确的定量实验，我们后面费那么大劲，为什么不在一开始就做好“定量”呢？您说是不？
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6楼2011-07-07 19:31:14
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-07-07 18:30:50
3. Ct值跟预变性时间关系不大。你的情况是模板浓度太低了。连稀释5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次测了RNA浓度，然后按照反转录试剂盒允许使用的RNA最大量来做反转录。之后梯度稀释（一般10倍一个梯度）再做荧光定量PCR。这个算是预实验，要解决的问题是模板该用多少ul。

4.如果内参随处理不同而变化的话，那不是个好内参啊。好的内参基因，不管如何处理，只要模板量一样，它的Ct值就应该差不多。不知道你师姐说的用不同引物是不是指用不同的内参基因，这方面还是问问你师姐吧。可以做内参的基因很多，actin、GAPDH、tublin等等，如果18s确实有这样的变化，建议你还是查查文献，换其他内参。

一家之言，仅供参考，欢迎各位同行指正哈
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3楼2011-07-07 09:28:59
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 赶快续，EPI等着你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金币+1): 不错，分析的详细 2011-07-10 00:40:53
1.需要测浓度的，理由：（1）不同的样品，用的RNA量一样（cDNA量也一样），定量结果更可靠。虽然内参可以校正样品量的差异，但是起始RNA量一样的话，结果更可靠，也更漂亮（理想情况是各个不同样品内参的Ct值非常接近）；（2）反转录酶能力不是无限的，说明书上都有说RNA的最大加入量，所以需要预先知道RNA浓度；（3）保证实验的可重复性。

2.DNA酶也会降解cDNA。不过可以用DNA酶处理RNA，之后灭活DNA酶（一般就是酚氯仿抽提），再做反转录。但是这样RNA的量损失很大，你样品少的话不推荐这样。当然通过引物设计，跨内含子，可以避免基因组DNA的扩增，不过引物有时候很难设计。最好的办法，还是好好提你的RNA，特别是加氯仿抽提之后取上清时，不要贪多，这样就能避免基因组DNA的污染了。再说了，你用试剂盒提的，如果还有基因组DNA污染，那就是操作不当啦。你样品宝贵，可以用其他材料，专门练练RNA提取。

（老婆逼睡觉，未完待续）
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2楼2011-07-07 02:13:23
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倔强的投手

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-07 18:30:59
1.最还把RNA稀释到一个浓度，然后做反转录，尽力把所有的条件都统一到一个水平，这样做出来的结果会更可靠
2.做定量的时候确实要考虑基因组DNA污染的问题，如果你不想取出gDNA的话，那就在设计引物上下功夫，引物跨内含子的话，就可以排除gDNA的影响。或者，可以再反转录前取出基因组DNA，Takara公司有这种反转录试剂盒，在RT之前加一步gDNA去除的步骤，效果还可以，我就是用的这个试剂盒，挺好的。
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4楼2011-07-07 16:17:54
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-07 09:28:59:
3. Ct值跟预变性时间关系不大。你的情况是模板浓度太低了。连稀释5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次测了RNA浓度，然后按照反转录试剂盒允许使用的RNA最大量来做反转录。之后梯度稀释（一般10倍一个梯度 ...

您好，我也顺便请教一下，我做的是原核生物的相对定量，内参基因不是就为了消除不同模板浓度带来的差异吗？那为什么还有调整RNA的浓度呢?我做和很多了，马上要写文章，但是没有调整其浓度到一致的水平，听你这么一说心里很忐忑！一定要调整吗？
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2011-07-07 18:46:39
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普通回帖

475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-07 19:31:14:
您说得没错，内参基因就是为了消除模板量差异的，不过调整到同样的浓度，扩增曲线会更好看（内参基因的曲线几乎重合）。而且还有一个作用，那就是检验这次PCR是否可靠：模板量一样的话，理论上内参基因的Ct值应 ...

哦，我明白了，我的只要结果就可以了，谢谢您详尽的解答
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
7楼2011-07-08 21:06:12
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475502411

铜虫 (著名写手)
谢谢您，我明白了没收获颇丰
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
8楼2011-07-08 21:18:00
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chenguestc

木虫 (职业作家)
引用回帖:
2030740楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-07-07 09:28:59
3. Ct值跟预变性时间关系不大。你的情况是模板浓度太低了。连稀释5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次测了RNA浓度，然后按照反转录试剂盒允许使用的RNA最大量来做反转录。之后梯度稀释（一般10倍一个梯度） ...

看到小木虫上好多人在问，如果内参CT值有差异，我也有此疑问，请问西瓜斑竹，内参CT值相差多大算是可接受范围，例如ACTIN GENE。
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9楼2012-12-25 08:09:50
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浮生、若梦

金虫 (小有名气)
十分感谢西瓜斑竹，学到不少东西！
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坚持自我
10楼2013-05-03 11:55:16
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