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请教real time pcr问题，谢谢！
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各位大虾们，小弟想咨询一些荧光定量的问题，如下： 1. RNA提取后，必须要测浓度吗，要根据浓度来决定加入多少ul的rna吗？ 2. 假如cDNA中还有DNA污染，该怎么办？能在cDNA中加入DNAseI除去DNA吗，这回切割cDNA吗？ 3. 我的模板稀释了四个梯度（5,25,125,625）选用18s做内参，结果CT值很大，都在30以上，后来调整了预变性时间，从5min增加到10min，CT值降为24左右，但是这对于内参基因来讲，仍然很大。我的目的基因CT值都在32-33以上。请问这是怎么回事？我的RNA用盒子提的，效果不错。反转录用的promega的m-mlv，用ologodt15（50uM）做引物。 4. 我有个同学做逆境，相同稀释倍数时，干旱处理时内参18S的CT在10左右，但做盐胁迫时相同18S的CT值竟然都在25左右，后来测了一下模板浓度， 都在1000-1300ng左右，感觉差不多呀，听一个师姐说做不同的逆境，可能需要不同的引物，请问这是怎么回事呢？ 小弟最近一直很迷茫，不敢轻易再上ABI7500去尝试了，因为材料有限，模板有限，不敢轻易得瑟模板。请各位大虾给予解答！谢谢！ |
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10楼2013-05-03 11:55:16