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ideal9268

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于real time PCR 的问题! 已有2人参与

用ABI 7000做real time PCR,TAKARA(SYBR)的试剂。结果内参没溶解曲线和扩增曲线,倒是另外的一个基因扩增正常。跑电泳有条带,与预计大小相同(绝对不是引物二聚体)。之前试过这些引物,都能扩出来的。如果说是模板的问题,为什么有的基因就扩出来的?有没有高手知道这是怎么回事啊?万分感谢!

祝大家元旦快乐!
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):谢谢交流 2011-01-02 13:18:13
你引物的问题吧,或者建议换一个内参基因。我曾做的实验,引物退火温度很高,Tm值在70左右,真正选择63度退火。两个引物之间的条带大小为200bp左右,一般溶解曲线等都很好!
内参的引物是不好选择的,保守性高,建议多设计几对引物,选择效果好的使用。而且最好RNA消化基因组DNA,然后再次抽提,选取2ugRNA作逆转录,将cDNA稀释40倍,使用!
建议做四个技术重复。
2楼2011-01-01 21:54:08
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ideal9268

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-01-01 21:54:08:
你引物的问题吧,或者建议换一个内参基因。我曾做的实验,引物退火温度很高,Tm值在70左右,真正选择63度退火。两个引物之间的条带大小为200bp左右,一般溶解曲线等都很好!
内参的引物是不好选择的,保守性高, ...

这个内参的引物前几天刚用过,没问题,效果还很好。这次PCR的条件也和上次完全一样。
还是谢谢你!
3楼2011-01-01 21:58:40
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ideal9268

铜虫 (小有名气)

没有人知道吗?必须解决这个问题啊!期待中······
4楼2011-01-02 17:29:25
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