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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于real time PCR 的问题！
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ideal9268

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于real time PCR 的问题！ 已有2人参与

用ABI 7000做real time PCR，TAKARA（SYBR）的试剂。结果内参没溶解曲线和扩增曲线，倒是另外的一个基因扩增正常。跑电泳有条带，与预计大小相同（绝对不是引物二聚体）。之前试过这些引物，都能扩出来的。如果说是模板的问题，为什么有的基因就扩出来的？有没有高手知道这是怎么回事啊？万分感谢！

祝大家元旦快乐！
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1楼 2011-01-01 21:20:59
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):谢谢交流 2011-01-02 13:18:13
你引物的问题吧，或者建议换一个内参基因。我曾做的实验，引物退火温度很高，Tm值在70左右，真正选择63度退火。两个引物之间的条带大小为200bp左右，一般溶解曲线等都很好！
内参的引物是不好选择的，保守性高，建议多设计几对引物，选择效果好的使用。而且最好RNA消化基因组DNA，然后再次抽提，选取2ugRNA作逆转录，将cDNA稀释40倍，使用！
建议做四个技术重复。
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2楼2011-01-01 21:54:08
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ideal9268

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-01-01 21:54:08:
你引物的问题吧，或者建议换一个内参基因。我曾做的实验，引物退火温度很高，Tm值在70左右，真正选择63度退火。两个引物之间的条带大小为200bp左右，一般溶解曲线等都很好！
内参的引物是不好选择的，保守性高， ...

这个内参的引物前几天刚用过，没问题，效果还很好。这次PCR的条件也和上次完全一样。
还是谢谢你！
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3楼2011-01-01 21:58:40
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ideal9268

铜虫 (小有名气)
没有人知道吗？必须解决这个问题啊！期待中······
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4楼2011-01-02 17:29:25
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