24小时热门版块排行榜    

查看: 3742  |  回复: 10
本帖产生 3 个 MolEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-07-07 18:30:50
3. Ct值跟预变性时间关系不大。你的情况是模板浓度太低了。连稀释5倍Ct值都那么大,那起始的RNA量太少了。下次测了RNA浓度,然后按照反转录试剂盒允许使用的RNA最大量来做反转录。之后梯度稀释(一般10倍一个梯度)再做荧光定量PCR。这个算是预实验,要解决的问题是模板该用多少ul。

4.如果内参随处理不同而变化的话,那不是个好内参啊。好的内参基因,不管如何处理,只要模板量一样,它的Ct值就应该差不多。不知道你师姐说的用不同引物是不是指用不同的内参基因,这方面还是问问你师姐吧。可以做内参的基因很多,actin、GAPDH、tublin等等,如果18s确实有这样的变化,建议你还是查查文献,换其他内参。

一家之言,仅供参考,欢迎各位同行指正哈
3楼2011-07-07 09:28:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

倔强的投手

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-07 18:30:59
1.最还把RNA稀释到一个浓度,然后做反转录,尽力把所有的条件都统一到一个水平,这样做出来的结果会更可靠
2.做定量的时候确实要考虑基因组DNA污染的问题,如果你不想取出gDNA的话,那就在设计引物上下功夫,引物跨内含子的话,就可以排除gDNA的影响。或者,可以再反转录前取出基因组DNA,Takara公司有这种反转录试剂盒,在RT之前加一步gDNA去除的步骤,效果还可以,我就是用的这个试剂盒,挺好的。
4楼2011-07-07 16:17:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): 够热心够辛苦 2011-07-09 08:03:44
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-07-07 18:46:39:
您好,我也顺便请教一下,我做的是原核生物的相对定量,内参基因不是就为了消除不同模板浓度带来的差异吗?那为什么还有调整RNA的浓度呢?我做和很多了,马上要写文章,但是没有调整其浓度到一致的水平,听你这 ...

您说得没错,内参基因就是为了消除模板量差异的,不过调整到同样的浓度,扩增曲线会更好看(内参基因的曲线几乎重合)。而且还有一个作用,那就是检验这次PCR是否可靠:模板量一样的话,理论上内参基因的Ct值应该都差不多,如果出现Ct值偏差很大的情况,那就有问题了。

我有一次摸索某样品的荧光定量PCR条件,实验室以前没人做过(注明:我是直接用的基因组DNA进行定量)。第一次做,内参基因的Ct值差异很大(用同样量的DNA),后面改进了样品DNA的提取方法,之后不同样品间内参基因的Ct值就很一致了。可能前面步骤导致了DNA的损失,或是有PCR反应的抑制剂吧。
试想假如我当时模板量用的不是一样的,那我就不能发现DNA提取方法需要改进,那么我得到的结果就很值得怀疑了。

我见过有实验室要求他们的学生,不同内参基因的Ct必须做到一致(SD<0.2还是多少),挺变态的,我师兄去他们那做实验都被折磨疯了:不断调样品浓度,但总也没法让内参Ct值的差异符合要求……一般实验室都只要求模板量用一样的即可,内参基因Ct值不要差太多,这种结果就接受了。像前面提到的实验室那样,通过调整模板浓度来使得内参一致,我觉得倒挺有造假嫌疑的。

您的情况,我觉得看您是否对自己的结果有自信了。我具的自己的例子,是一个特例:提取步骤里有能抑制酶活的成分,故Ct值差异引起了我对提取步骤的怀疑(毕竟是自己摸索,想得比较多)。如果您的一整套方法都很成熟了,那么内参出问题的可能性就很小,这样的结果是可靠的。毕竟,当初引入内参,为的就是消除模板量的差异,内参没出问题,那么模板量用的不一样也没关系。
前面那个“变态”的实验室,他们发表的结果里需要有扩增曲线的图,不得不把图做得“漂亮”些。您的情况,我估计就放上最终定量的结果就可以了吧?不是专门研究定量技术的倒是没必要把扩增曲线图和Ct值这些放上去,那么内参Ct值有点差异倒不会影响文章发表。

其实,荧光定量PCR是一个精确的定量实验,我们后面费那么大劲,为什么不在一开始就做好“定量”呢?您说是不?
6楼2011-07-07 19:31:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 billy8580 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +4 angus9576 2026-08-17 8/400 2026-08-17 17:26 by angus9576
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 EWi2p09MOOv8 2026-08-16 3/150 2026-08-17 16:35 by CBFiACZS7HAK
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +34 医学老男孩 2026-08-13 81/4050 2026-08-17 16:20 by yudaoqian88
[基金申请] 时间戳变了,能看出什么问题? +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +12 Ldrop2023 2026-08-13 15/750 2026-08-17 15:02 by 小豌豆_发芽
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 i7NFEVbjQMM5 2026-08-16 4/200 2026-08-17 12:10 by 4GBAYCdVQoK3
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 6GojgJvkDudM 2026-08-16 4/200 2026-08-17 11:46 by 4GBAYCdVQoK3
[教师之家] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 6GojgJvkDudM 2026-08-16 3/150 2026-08-17 09:49 by xLVPIRuSvCUe
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
信息提示
请填处理意见