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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 酶切的相关问题

本人做蛋白的体外表达，现在已把目的片段连接到T载体测序（测序中），上、下游引物分别含有NcoI和BamHI酶切位点，可是突然发现我的T载体在TA克隆位点附近（不超过10个碱基）也有BamHI酶切位点，那我后续要用这两个酶双酶切T载体获得目的基因的话，载体上的BamHI酶切位点对我后续实验的影响大不大啊？恳请高人指点一下！
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1楼 2011-07-05 18:42:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 学习了！ 2011-07-05 19:59:52
amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-07-05 20:04:19
不过话说回来，你为什么要先TA克隆呢？如果PCR出来之后直接将表达载体和外源片段双酶切，然后连接，再转化大肠杆菌，挑取阳性单克隆培养提质粒，这时候再测序就省事了，也不用担心你载体上的BamHI酶切位点的干扰了，这样一来整个含有你的片段的质粒上就只有一个BamHI位点了，完全没有隐患。

测序费钱也不多，一个反应就30块钱而已，但可以测定超过600bp。

而且要双向测通，因为测序是两端不准的，从单链得到的结果可能含有不准的区间，需要从另一条单链测得的结果来拼接。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-05 19:45:03
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-05 19:16:53
amisking: 2011-07-05 20:04:13
BamHI虽然说活力比较高，但是也不排除可能有失效或者操作不当造成酶切不完全，只能切去其中一个位点的情况，因为这两个位点相隔很近，跑胶的时候是看不出10个碱基的差别的，这样就可能造成回收的外源片段中有一部分还带有几个载体上的碱基。

我建议你设计引物的时候不要选用载体上存在的酶切位点，消除这个隐患。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-05 18:57:15
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-05 18:57:15:
BamHI虽然说活力比较高，但是也不排除可能有失效或者操作不当造成酶切不完全，只能切去其中一个位点的情况，因为这两个位点相隔很近，跑胶的时候是看不出10个碱基的差别的，这样就可能造成回收的外源片段中有一部 ...

好不容易才设计出能P出目的条带的引物啊，我觉得还不如换T载体呢，因为我把目的片段连到Ｔ载体无非就是为了测序和让目的片段进行扩增的目的，最后是要双酶切目的基因，所以换用一个不含我引物酶切位点的载体比较好吧，您觉得呢？我现在就是纠结要不要换T载体，因为那个比较贵，但是如果我不换载体，我就怕到时切到的目的条带会有像您说的情况，纠结啊……
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3楼2011-07-05 19:18:46
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-05 19:45:03:
不过话说回来，你为什么要先TA克隆呢？如果PCR出来之后直接将表达载体和外源片段双酶切，然后连接，再转化大肠杆菌，挑取阳性单克隆培养提质粒，这时候再测序就省事了，也不用担心你载体上的BamHI酶切位点的干扰了 ...

因为我之前在DNA上P的时候发现我的基因是多拷贝的，所以我怕我RT-PCR出来的带也不是纯的，所以想先挑单克隆连到Ｔ载体，再酶切的！不过现在还不知道呢，得等到测序结果出来才知道是单一条带还是杂带。
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5楼2011-07-05 19:57:04
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