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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切的相关问题
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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 酶切的相关问题

本人做蛋白的体外表达，现在已把目的片段连接到T载体测序（测序中），上、下游引物分别含有NcoI和BamHI酶切位点，可是突然发现我的T载体在TA克隆位点附近（不超过10个碱基）也有BamHI酶切位点，那我后续要用这两个酶双酶切T载体获得目的基因的话，载体上的BamHI酶切位点对我后续实验的影响大不大啊？恳请高人指点一下！
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1楼 2011-07-05 18:42:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-05 19:16:53
amisking: 2011-07-05 20:04:13
BamHI虽然说活力比较高，但是也不排除可能有失效或者操作不当造成酶切不完全，只能切去其中一个位点的情况，因为这两个位点相隔很近，跑胶的时候是看不出10个碱基的差别的，这样就可能造成回收的外源片段中有一部分还带有几个载体上的碱基。

我建议你设计引物的时候不要选用载体上存在的酶切位点，消除这个隐患。
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2楼2011-07-05 18:57:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 学习了！ 2011-07-05 19:59:52
amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-07-05 20:04:19
不过话说回来，你为什么要先TA克隆呢？如果PCR出来之后直接将表达载体和外源片段双酶切，然后连接，再转化大肠杆菌，挑取阳性单克隆培养提质粒，这时候再测序就省事了，也不用担心你载体上的BamHI酶切位点的干扰了，这样一来整个含有你的片段的质粒上就只有一个BamHI位点了，完全没有隐患。

测序费钱也不多，一个反应就30块钱而已，但可以测定超过600bp。

而且要双向测通，因为测序是两端不准的，从单链得到的结果可能含有不准的区间，需要从另一条单链测得的结果来拼接。
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4楼2011-07-05 19:45:03
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-07-06 07:40:11
那你能不能重新设计引物，把BamHI酶切位点换成外源片段上没有的位点？一个位点6个碱基，对于整个引物来说不算太长，也不一定就不能P出来。

BamHI是个常用的酶，很多载体上都有这个位点的，如果你想换没有这个位点的T载体，那就只能找找了。
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6楼2011-07-05 21:57:12
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