| 查看: 2863 | 回复: 19 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
5RACE PCR总是出不来条带，怎么办？急求助
|
|||
|
我的实验过程具体是这样的： 两个月前我设计了三个反向引物用来做5RACE，由于引物合成温度只有62度，我就按照70-65跑touch down,其中两个引物PCR出来两个条带，跟我的目的条带接近，准备做重复进行回收，重复的时候没了，变成了一片汪洋的拖带，于是我降温升温，改了它三四次，未果；继续设引物，有三个，与前面相同的情况，开始PCR的时候有结果，但是一重复就没了，又N轮的升温，降温，未果，继续换引物，这回为保险起见，请教我们实验室最稳妥的大师兄帮我设计的，同样，第一次跑出来有一个引物有条带（一次PCR，UPM和GST跑得），大小合适（1300bp），做二次（nup和GST），未果，一片汪洋的拖带，再来了一轮升温降温，未果........于是我冒险做了四个一次PCR的重复和单引物，结果是，单引物跑得巨亮无比，且大小和之前跑出来的条带一样大，而那四个重复全是弥散，没有集中在哪个条带附近的趋势，实在是想不出招了。求大虾们助啊~ PS：1 已经得到的序列距5‘端至少1300bp；2 我试图设计兼并引物在5端这中间得出一段，结果是出来两段大小差不多的条带，但是测序结果都不是....... 3 我想是不是单引物可以试着重复回收？有没有可能是？不过只能确定一端，另一端没招 4 3RACE端较保守已经完工，5端很不保守，已经做了三个月了，我已经黔驴技穷了，急切求助~殷切盼望大家帮助~~ |
回复此楼» 收录本帖的淘贴专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有179人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
-
韩国海关检测食用植物油中的苯并芘用的是哪种方法？
已经有0人回复
-
现有pP43NMK质粒，想换了pHT43，或者其他芽孢杆菌过表达质粒
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助PCR老是跑不出条带
已经有16人回复
- 【求助/交流】pcr条带不亮
已经有6人回复
- 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
已经有10人回复
- 【求助/交流】pcr结果电泳条带很淡
已经有14人回复
- 【求助/交流】菌液PCR结束，肉眼直接看到条带可能不？
已经有15人回复
- 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带
已经有7人回复
- 【求助/交流】DGGE 胶回收后做PCR没有条带是怎么回事？？急！！！
已经有36人回复
- 【求助/交流】PCR引物设计出来了，但酶切之后电泳没条带啊
已经有18人回复
- 【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why?
已经有20人回复
- 【求助/交流】RT-PCR总是得不到目的条带
已经有12人回复
9楼2011-06-27 13:34:42
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
2楼2011-06-22 09:16:42
jinkui960
至尊木虫 (知名作家)
- MolEPI: 22
- 应助: 1220 (讲师)
- 金币: 10255.5
- 散金: 1000
- 红花: 42
- 沙发: 1
- 帖子: 5796
- 在线: 517小时
- 虫号: 1327313
- 注册: 2011-06-20
- 性别: GG
- 专业: 生物防治
【答案】应助回帖
★ ★ ★
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-06-22 18:50:08
likii(金币+9): 那依你的意思我不用做RACE了，直接用cDNA为模板做DNA walking 就可以么？求详解～这个我了解的不多 2011-06-26 01:37:08
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-06-22 18:50:08
likii(金币+9): 那依你的意思我不用做RACE了，直接用cDNA为模板做DNA walking 就可以么？求详解～这个我了解的不多 2011-06-26 01:37:08
|
我以前做过5和3-RACE，都比较顺利，用的是Invitrogen的盒子。不过现在我的学生一般不让做RACE，试剂和比较贵。你现在的情况，我觉得换个盒子换种方法可能更有效。 我们现在扩增未知序列一般都用Walking试剂盒，常用的有韩国seegene公司的DNA WALKING试剂盒，以及Takara公司的 genome walking试剂盒。Walking试剂盒是以DNA作为模板进行扩增，所以不用担心降解，效率也高。seegene公司的DNA WALKING试剂盒价格比Takara公司的 genome walking试剂盒高一点，但个人感觉seegene公司的DNA WALKING试剂盒适用性更广，效率更高，但有时候seegene公司的DNA WALKING试剂盒扩不出来，用Takara盒子能扩增出来。 seegene公司的DNA WALKING试剂盒10次得价格是3000人民币，25次是5000多一点。Takara盒子相对便宜，10次1500，但我更偏向于用seegene公司的盒子。 希望对你有帮助！ |
3楼2011-06-22 18:29:12
jinkui960
至尊木虫 (知名作家)
- MolEPI: 22
- 应助: 1220 (讲师)
- 金币: 10255.5
- 散金: 1000
- 红花: 42
- 沙发: 1
- 帖子: 5796
- 在线: 517小时
- 虫号: 1327313
- 注册: 2011-06-20
- 性别: GG
- 专业: 生物防治
4楼2011-06-26 10:38:57
5