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5RACE PCR总是出不来条带，怎么办？急求助
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我的实验过程具体是这样的： 两个月前我设计了三个反向引物用来做5RACE，由于引物合成温度只有62度，我就按照70-65跑touch down,其中两个引物PCR出来两个条带，跟我的目的条带接近，准备做重复进行回收，重复的时候没了，变成了一片汪洋的拖带，于是我降温升温，改了它三四次，未果；继续设引物，有三个，与前面相同的情况，开始PCR的时候有结果，但是一重复就没了，又N轮的升温，降温，未果，继续换引物，这回为保险起见，请教我们实验室最稳妥的大师兄帮我设计的，同样，第一次跑出来有一个引物有条带（一次PCR，UPM和GST跑得），大小合适（1300bp），做二次（nup和GST），未果，一片汪洋的拖带，再来了一轮升温降温，未果........于是我冒险做了四个一次PCR的重复和单引物，结果是，单引物跑得巨亮无比，且大小和之前跑出来的条带一样大，而那四个重复全是弥散，没有集中在哪个条带附近的趋势，实在是想不出招了。求大虾们助啊~ PS：1 已经得到的序列距5‘端至少1300bp；2 我试图设计兼并引物在5端这中间得出一段，结果是出来两段大小差不多的条带，但是测序结果都不是....... 3 我想是不是单引物可以试着重复回收？有没有可能是？不过只能确定一端，另一端没招 4 3RACE端较保守已经完工，5端很不保守，已经做了三个月了，我已经黔驴技穷了，急切求助~殷切盼望大家帮助~~ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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jinkui960
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-06-22 18:50:08
likii(金币+9): 那依你的意思我不用做RACE了，直接用cDNA为模板做DNA walking 就可以么？求详解～这个我了解的不多 2011-06-26 01:37:08
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-06-22 18:50:08
likii(金币+9): 那依你的意思我不用做RACE了，直接用cDNA为模板做DNA walking 就可以么？求详解～这个我了解的不多 2011-06-26 01:37:08
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我以前做过5和3-RACE，都比较顺利，用的是Invitrogen的盒子。不过现在我的学生一般不让做RACE，试剂和比较贵。你现在的情况，我觉得换个盒子换种方法可能更有效。 我们现在扩增未知序列一般都用Walking试剂盒，常用的有韩国seegene公司的DNA WALKING试剂盒，以及Takara公司的 genome walking试剂盒。Walking试剂盒是以DNA作为模板进行扩增，所以不用担心降解，效率也高。seegene公司的DNA WALKING试剂盒价格比Takara公司的 genome walking试剂盒高一点，但个人感觉seegene公司的DNA WALKING试剂盒适用性更广，效率更高，但有时候seegene公司的DNA WALKING试剂盒扩不出来，用Takara盒子能扩增出来。 seegene公司的DNA WALKING试剂盒10次得价格是3000人民币，25次是5000多一点。Takara盒子相对便宜，10次1500，但我更偏向于用seegene公司的盒子。 希望对你有帮助！ |
3楼2011-06-22 18:29:12
jinkui960
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Seegene的DNA walking试剂盒和TAKARA 的genome walking试剂盒我都用过，而且我们做过不同的微生物，包括不同的真菌和细菌。 Seegene的盒子适应性比较广，很少扩不出片段的，但扩增片段一般在1000 bp左右，适合测序，如果扩增得到的片段不够长，你可以在新扩增的序列上设计引物继续扩增第二次，直到得到你需要的片段长度。 TAKARA 的genome walking试剂盒我感觉适应性没有Seegene的盒子好，有时候扩增得不到片段，也有可能我们的引物设计有问题，它的扩增有时候达到2-3kb，片段大了也不好测序。 我们通过 walking技术，从500bp的片段扩增，经过2-3次 walking以后，得到5000-6000bp的目的基因。 |
5楼2011-06-27 09:06:58
西瓜
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