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11wm11

银虫 (小有名气)

[求助] 酶切质粒时，怎样鉴定质粒是否被切开了啊？

酶切质粒时，怎样鉴定质粒是否被切开了啊？
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1楼 2011-05-15 06:24:13
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-15 09:48:03
根据说明书，确定酶切条件，温度，时间

一般是2到3个小时，或者难切一点的过夜

完后加入loadingbuffer，跑琼脂糖凝胶电泳，

一般分以下几个孔，
marker ，  原始质粒， 一个酶单切，  另一个单切， 两个酶双切

单切的两个条带一样大小，但是比原始质粒跑的慢

双切的如果有连入片段，就会是两条带，一小一大
如果没有连入片段，应该跟单切位置差不多大
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2楼2011-05-15 06:42:44
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-05-15 09:48:16
11wm11(金币+2): 2011-05-15 21:09:19
11wm11(金币+1): 2011-05-17 21:25:16
首先，你提完的质粒跑电泳应该是三条带，等酶切后跑电泳是一条带了。

   如果你连上目的条带，你酶切后的条带大小，应该是质粒大小加目的条带的大小。

   如果你做的双酶切，应该是两条带，一条是你目的条带的大小，一条是质粒大小。
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
3楼2011-05-15 08:51:28
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-15 19:44:31
11wm11(金币+2): 2011-05-15 21:09:36
补充下，你选的酶最好是单切割位点的，并且所连片段中不会有酶切位点。这样效果最好了！最能说明问题！
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4楼2011-05-15 18:42:43
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11wm11

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 疯狂修行者 at 2011-05-15 08:51:28:
首先，你提完的质粒跑电泳应该是三条带，等酶切后跑电泳是一条带了。

   如果你连上目的条带，你酶切后的条带大小，应该是质粒大小加目的条带的大小。

   如果你做的双酶切，应该是两条带，一条是你目的条带 ...

谢谢哈，我是做连接转化的新手，挑的菌都没有目的片段，所以我怀疑是不是质粒没切好啊。晚上跑过电泳发现质粒酶切前后不在同一条线上，应该能说明质粒切好了吧。
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5楼2011-05-15 21:15:13
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11wm11

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-05-15 18:42:43:
补充下，你选的酶最好是单切割位点的，并且所连片段中不会有酶切位点。这样效果最好了！最能说明问题！

谢谢~我做同源重组连接。是新手，用的质粒是PHW2000，酶是stul。
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6楼2011-05-15 21:19:51
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 11wm11 at 2011-05-15 21:15:13:
谢谢哈，我是做连接转化的新手，挑的菌都没有目的片段，所以我怀疑是不是质粒没切好啊。晚上跑过电泳发现质粒酶切前后不在同一条线上，应该能说明质粒切好了吧。

质粒提取后有三条带，是超螺旋、开环和复制中间体。你说的酶切后不再一条线上，是和其中两条不在一条线上吧？如果是双酶切，那就应该是两条。如果是单酶切，就应该是和其他一条差不多大小的。
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
7楼2011-05-21 14:31:22
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