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xwsooo

银虫 (小有名气)

[求助] PCR预计产物与结果不一致,求分析

前一阵子,我的PCR产物条带一直弥散,后来改体系后,在弥散中看到有条带了,我的PCR产物预计在300多bp,但是跑电泳(2%胶)看大约在400多bp。我自己搜索了下,考虑几个原因:

引物与非靶序列结合,那么重新设计引物???
我的退火温度现在设在56度(引物合成单是56度),提高退火温度???
循环数在25个循环,那么就不用再减少循环数了吧。
现在所用的是:
引物浓度在10uM,1ul
dNTP2.5mM,4ul
taq酶(5U/uL)0.2ul
25ul反应体系

还有什么解决办法么?
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

xwsooo(金币+8): 谢谢 2011-04-25 08:30:44
你当初有没有进行温度梯度的设定?
体系一般不会出现什么问题吧?
再试试。。。
延伸1m就可以了、、、
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-24 22:41:58
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xwsooo

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-24 22:41:58:
你当初有没有进行温度梯度的设定?
体系一般不会出现什么问题吧?
再试试。。。
延伸1m就可以了、、、

恩,还木有作温度梯度,酱紫就可以得到我想要的那个条带了么???
3楼2011-04-25 08:31:37
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shaquila

金虫 (正式写手)

引物合成单的温度都偏低,去网上在线预测把,可以试试六十度左右。延伸时间二十秒就够了
4楼2011-04-25 08:42:56
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xwsooo

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-25 08:42:56:
引物合成单的温度都偏低,去网上在线预测把,可以试试六十度左右。延伸时间二十秒就够了

嗯,我的正是延伸20秒~~打算今天提高到60度试试看,谢谢
5楼2011-04-25 08:55:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-04-25 18:52:05
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-25 08:31:37:
恩,还木有作温度梯度,酱紫就可以得到我想要的那个条带了么???

当然必须先做个温度梯度了,看看你两条引物的Tm值,然后加起来除以2之后,在这个温度上下再加减几度,多设置几个梯度进行扩增,然后看看哪一个温度下条带是最亮的,以后就用此温度进行扩增。。。。尝试一下哈。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-04-25 09:54:10
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