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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR预计产物与结果不一致，求分析
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[求助] PCR预计产物与结果不一致，求分析

前一阵子，我的PCR产物条带一直弥散，后来改体系后，在弥散中看到有条带了，我的PCR产物预计在300多bp，但是跑电泳（2%胶）看大约在400多bp。我自己搜索了下，考虑几个原因：

引物与非靶序列结合，那么重新设计引物？？？
我的退火温度现在设在56度（引物合成单是56度），提高退火温度？？？
循环数在25个循环，那么就不用再减少循环数了吧。
现在所用的是：
引物浓度在10uM，1ul
dNTP2.5mM,4ul
taq酶(5U/uL)0.2ul
25ul反应体系

还有什么解决办法么？
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1楼 2011-04-24 22:28:36
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

xwsooo(金币+8): 谢谢 2011-04-25 08:30:44
你当初有没有进行温度梯度的设定？
体系一般不会出现什么问题吧？
再试试。。。
延伸1m就可以了、、、
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-24 22:41:58
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-24 22:41:58:
你当初有没有进行温度梯度的设定？
体系一般不会出现什么问题吧？
再试试。。。
延伸1m就可以了、、、

恩，还木有作温度梯度，酱紫就可以得到我想要的那个条带了么？？？
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3楼2011-04-25 08:31:37
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shaquila

金虫 (正式写手)
引物合成单的温度都偏低，去网上在线预测把，可以试试六十度左右。延伸时间二十秒就够了
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4楼2011-04-25 08:42:56
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-04-25 08:42:56:
引物合成单的温度都偏低，去网上在线预测把，可以试试六十度左右。延伸时间二十秒就够了

嗯，我的正是延伸20秒~~打算今天提高到60度试试看，谢谢
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5楼2011-04-25 08:55:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-04-25 18:52:05
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-25 08:31:37:
恩，还木有作温度梯度，酱紫就可以得到我想要的那个条带了么？？？

当然必须先做个温度梯度了，看看你两条引物的Tm值，然后加起来除以2之后，在这个温度上下再加减几度，多设置几个梯度进行扩增，然后看看哪一个温度下条带是最亮的，以后就用此温度进行扩增。。。。尝试一下哈。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-04-25 09:54:10
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