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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求解蛋白质分离纯化的难题
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609351499

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】求解蛋白质分离纯化的难题

大家好，最近在做蛋白质的分离纯化实验，实验中遇到了一些难题，还请高手指点。
    我做真菌产一种酶的分离纯化，但是该菌也产很多多糖，不知用什么办法除去？
    对发酵液盐析的蛋白质实验时，经过离心，得到的片状物浮在液面上，管底部液体澄清，没有沉淀，请问这是什么原因，怎么解决？Sample Text
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1楼 2011-03-11 18:15:09
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
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发酵液中加入硫酸铵达到一定的饱和度之后，理论上是绝对有蛋白质沉淀下来的，即使没有蛋白质沉淀，那至少发酵液里的菌丝碎片和培养基不溶成分也会沉淀。没有沉淀就说明沉淀跑到液体上层去了。这令我想到一个现象，双水相。

硫酸铵是无机盐，达到一定浓度时会与一些有机物形成双水相，上相为有机相，下相为无机相。

建议尝试一下双水相去除发酵液杂质和有机杂质，之后无机相继续加入硫酸铵盐析。这样，碎片、色素、有机物、杂质蛋白质都能去除很多。
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9楼2011-03-11 21:49:21
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~明晓溪~

木虫 (正式写手)
★
609351499(金币+2):谢谢参与
我也遇到同样的事情，实际上那些漂浮物可以丢掉了，估计是一些多糖，你不放心的话，跑个电泳看看。我觉的管壁上多少会有些蛋白的，你洗洗看看。
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3楼2011-03-11 18:35:22
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★
609351499(金币+2):谢谢参与
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Originally posted by 609351499 at 2011-03-11 18:15:09:
大家好，最近在做蛋白质的分离纯化实验，实验中遇到了一些难题，还请高手指点。
    我做真菌产一种酶的分离纯化，但是该菌也产很多多糖，不知用什么办法除去？
    对发酵液盐析的蛋白质实验时，经过离心，得到 ...

走一次凝胶色谱试试，分离到的组分测下糖的含量。
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4楼2011-03-11 20:46:55
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weishengsu5

木虫 (正式写手)
★
609351499(金币+2):谢谢参与
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Originally posted by zyxme at 2011-03-11 18:33:05:

学习下
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5楼2011-03-11 20:55:07
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zdq516122164

新虫 (小有名气)
★
609351499(金币+2):谢谢参与
我理解  是盐析 使发酵液密度大了 你看呢 我们也是 这样
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6楼2011-03-11 21:10:56
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zdq516122164

新虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by zdq516122164 at 2011-03-11 21:10:56:
我理解  是盐析 使发酵液密度大了 你看呢 我们也是 这样

我理解  是盐析 使发酵液密度大了 你看呢 我们也是 这样
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7楼2011-03-11 21:11:11
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zdq516122164

新虫 (小有名气)
离心后应该就下来了
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8楼2011-03-11 21:11:29
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892091690

银虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-03-11 21:49:21:
发酵液中加入硫酸铵达到一定的饱和度之后，理论上是绝对有蛋白质沉淀下来的，即使没有蛋白质沉淀，那至少发酵液里的菌丝碎片和培养基不溶成分也会沉淀。没有沉淀就说明沉淀跑到液体上层去了。这令我想到一个现象， ...

我是从米曲霉麸皮曲中提取a-淀粉酶 要怎么处理呢？
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11楼2012-03-14 12:06:00
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冼亮淀粉酶

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11楼: Originally posted by 892091690 at 2012-03-14 12:06:00:
我是从米曲霉麸皮曲中提取a-淀粉酶 要怎么处理呢？

固体曲加水用果酱机粉碎，浸泡一小时，离心即可，这是我现用的方法。
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12楼2012-03-15 01:03:03
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892091690

银虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-15 01:03:03:
固体曲加水用果酱机粉碎，浸泡一小时，离心即可，这是我现用的方法。

用研钵捣碎行么？
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13楼2012-03-15 10:44:59
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dorecnu

木虫 (正式写手)
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多糖是否可以考虑使用CTAB去除呢？
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14楼2012-03-15 12:16:04
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冼亮淀粉酶

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1349019楼: Originally posted by 892091690 at 2012-03-15 10:44:59:
用研钵捣碎行么？

不好，孢子在曲干的时候会飞得到处都是。
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15楼2012-03-15 23:11:50
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892091690

银虫 (小有名气)
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1349168楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-15 23:11:50:
不好，孢子在曲干的时候会飞得到处都是。

我在提取淀粉酶时用硫酸铵盐析沉淀 但是用量不知道多少 自己随便加了大约原菌液的5倍 后来一些列步骤下来 大概稀释了200倍 测OD值时怎么测都是0~0.100之间的数值 是不是我稀释的倍数太大了？如果有3毫升原菌液，那么硫酸铵要加入大概多少毫升呢？
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16楼2012-03-17 12:18:08
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冼亮淀粉酶

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1349426楼: Originally posted by 892091690 at 2012-03-17 12:18:08:
我在提取淀粉酶时用硫酸铵盐析沉淀 但是用量不知道多少 自己随便加了大约原菌液的5倍 后来一些列步骤下来 大概稀释了200倍 测OD值时怎么测都是0~0.100之间的数值 是不是我稀释的倍数太大了？如果有3毫升原菌液， ...

这个，有没有测过酶活力残留多少？原菌液的5倍是什么意思？感觉需要整理一下，说得详细一点。
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17楼2012-03-17 18:58:27
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892091690

银虫 (小有名气)
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509518楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-03-11 21:49:21:
发酵液中加入硫酸铵达到一定的饱和度之后，理论上是绝对有蛋白质沉淀下来的，即使没有蛋白质沉淀，那至少发酵液里的菌丝碎片和培养基不溶成分也会沉淀。没有沉淀就说明沉淀跑到液体上层去了。这令我想到一个现象， ...

我用DNS法测固态发酵所产淀粉酶活性时 参比管中是不加淀粉的粗酶液，测定管是加了淀粉的酶液，测得结果要么负值要么0~0.1之间的数值，可能是什么原因呢？一定要用蒸馏水做参比吗？我看有些文献中还设有对照管 没看懂对照管和测定管有什么不同~~~
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19楼2012-03-22 12:52:05
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冼亮淀粉酶

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1350208楼: Originally posted by 892091690 at 2012-03-22 12:52:05:
我用DNS法测固态发酵所产淀粉酶活性时 参比管中是不加淀粉的粗酶液，测定管是加了淀粉的酶液，测得结果要么负值要么0~0.1之间的数值，可能是什么原因呢？一定要用蒸馏水做参比吗？我看有些文献中还设有对照管 没 ...

国内的论文要选择性地看，有些是作假的。

2.2.6.1.4淀粉酶活力的测定
（1）收集发酵上清液并作适当稀释。
（2）在2mL EP管中加入350µL含0.25%可溶性淀粉的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在已调整至需要温度的水浴锅中预热3min；
（3）取淀粉酶粗酶液50µl加入至缓冲液中；
（4）到达设定时间后，每管加0.8ml DNS试剂终止酶反应；
（5）沸水煮5 min后冷水冷却，瞬时离心将附着在管壁上的液体甩下；
（6）沸水煮5min的灭活上清液作同样处理作为对照；
（7）取200µl加到血清板上，测定540nm处光吸收值；
每次实验设三个重复，粗酶液活力计算依照以下方法：
                        G×n×20
1ml发酵上清液所含有酶活单位= ——————               
                         1000
式中G：经淀粉酶作用后释放的葡萄糖量；n：上清液稀释倍数；1000：释放的葡萄糖量µg换算至mg；20：参与反应的粗酶液的量50µl换算至1mL
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20楼2012-03-22 14:19:01
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冼亮淀粉酶

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µl为乱码，微升
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21楼2012-03-22 14:20:37
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新艺

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509518楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-03-11 21:49:21
发酵液中加入硫酸铵达到一定的饱和度之后，理论上是绝对有蛋白质沉淀下来的，即使没有蛋白质沉淀，那至少发酵液里的菌丝碎片和培养基不溶成分也会沉淀。没有沉淀就说明沉淀跑到液体上层去了。这令我想到一个现象，双 ...

不知道楼主，用没用这个朋友的方法。我以前也遇到过类似楼主的情况，之前是从真菌发酵菌丝体中提取蛋白的，也是加了硫酸铵后发现底部没沉淀，而在上层出现了絮状物续集，但是在上层用分液漏斗收集了之后，后续试验做了发现不是蛋白，当时没找到解决方法，但是对这个现象非常感兴趣，但是时间太紧没有深究。
如果，楼主已经解决了这个问题，还请指教一下给个解惑的方法，谢了！
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22楼2012-09-09 10:55:30
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冼亮淀粉酶

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1364657楼: Originally posted by 新艺 at 2012-09-09 10:55:30
不知道楼主，用没用这个朋友的方法。我以前也遇到过类似楼主的情况，之前是从真菌发酵菌丝体中提取蛋白的，也是加了硫酸铵后发现底部没沉淀，而在上层出现了絮状物续集，但是在上层用分液漏斗收集了之后，后续试验 ...

我后来没有再用双水相，因为方法不止一种，有可能很不容易的解决了问题，才发现可以绕过问题，还有别的方法。
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23楼2012-09-09 15:18:26
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zyxme2楼
2011-03-11 18:33   回复  
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824wandou10楼
2011-03-11 23:27   回复  
 
kedaxiaoyu18楼
2012-03-20 16:03   回复  
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