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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】启动子构建!!!!

各位虫友,紧急救助!
     最近一直在构建启动子,连接(连接效率很低很低)酶切都切出来了的,可是测序结果根本就不匹配。这是为什么,是哪里出了问题????
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睡着数绵羊(金币+1): 2011-02-19 12:18:49
翱宇(金币+1): 谢谢交流 2011-02-19 12:21:32

非特异PCR?换引物试试
连接效率低可能是酶挂了,或者放太久buffer的ATP挂了(我挂了…………
2楼2011-02-19 12:03:00
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-02-19 04:03:00:
非特异PCR?换引物试试
连接效率低可能是酶挂了,或者放太久buffer的ATP挂了(我挂了…………

可是P出的条带很清晰,在目的片段大小处就一条带的,酶都是新的!
3楼2011-02-19 12:21:11
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翱宇

禁虫 (正式写手)


★ ★
1949stone(金币+2): 值得参考 2011-02-19 12:34:15
睡着数绵羊(金币+1): 2011-02-19 18:06:54

其实一个实验的失败有很多原因,不知楼主是怎样连接的,粘性末端,还是平末端,还是一平一粘。粘性末端的话,建议假如水,载体和片段后65度温育10分钟,中间弹几次,然后放冰上2分钟,使得粘性末端自身的搭配被打开,然后加入buffer和酶,16度连接几小时。另外可以的话建议买感受态做转化,人家做的转化效率就是高,可以试试呢。
4楼2011-02-19 12:24:28
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引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-02-19 04:21:11:
可是P出的条带很清晰,在目的片段大小处就一条带的,酶都是新的!

有没有试过P完之后直接测序
或者先连T再测
5楼2011-02-19 13:20:05
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-02-19 04:24:28:
其实一个实验的失败有很多原因,不知楼主是怎样连接的,粘性末端,还是平末端,还是一平一粘。粘性末端的话,建议假如水,载体和片段后65度温育10分钟,中间弹几次,然后放冰上2分钟,使得粘性末端自身的搭配被打 ...

虽说连接效率低,可还是连上了,但是测序就不对
6楼2011-02-19 18:05:27
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-02-19 05:20:05:
有没有试过P完之后直接测序
或者先连T再测

这个到没有,是不是说可能P出的片段就不对,是吗,可是在那个位置上P出来就是一条带啊。
7楼2011-02-19 18:06:29
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引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-02-19 10:06:29:
这个到没有,是不是说可能P出的片段就不对,是吗,可是在那个位置上P出来就是一条带啊。

走夜路多了也会撞鬼的……
8楼2011-02-19 18:07:45
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简单回复
2011-02-19 18:19   回复  
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-02-19 10:07:45: 走夜路多了也会撞鬼的……

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