应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助
51/1返回列表
查看: 5572  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

ikaren2013

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助

由于要做点突变，且突变位置很特殊很特殊，（考虑到突变位置，引物3'端配对长度），所以只能针对突变点限定性地设计了几对引物。 软件给出的Tm值相当高。相对于以下的结果图
       第一对引物 Tm
      
       第二对引物 Tm
      
       第三对引物 Tm
      
       第四对引物 Tm
      
       摸条件四次结果，都非常不好，（也用过热启动，什么都没P出来，只有引物二聚体），急求解决方法.目的片段大小约为700bp
      

      

       下图能看到每个体系都有十分微弱的目的条带      
      

       下图中的1,2,3为两点温度法
      

[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-13 22:09:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
rainwander(金币+2):没操作过也没问题，积极参与的精神可嘉~~ 2011-01-15 10:52:21
我没做过定点突变，但是我觉得要考虑两个因素，一个是启始的引物模板mismatch，而且退火温度要根据真正匹配的部份来确定，好像设计引物的软件可以算出mismatch的退火温度，第二点要考虑mismatch不能太靠近三端吧，不然结合有问题。可以考虑一开始较低温度扩增，后提高温度。也可以设计一个长引物和然后去除其三端部份序列得到一个短引物，用两引物的混合物做为引物进行PCR，注意长引物量要小于短引物，至少1:5。一点拙见，呵呵，没实际操作过
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2011-01-15 10:36:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):鼓励交流~~ 2011-01-14 09:07:17
我的引物都是20-26bp  没做过40bp的。。。。。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-01-13 23:51:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2):热心的虫虫~~ 2011-01-14 09:08:07
强烈建议LZ换pfu酶，fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题，PCR要求没这么严格。关键是酶，KOD太矫情了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-01-14 06:53:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-14 10:12:49
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-01-14 06:53:21:
强烈建议LZ换pfu酶，fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题，PCR要求没这么严格。关键是酶，KOD太矫情了。

KOD还好阿，用takara的extaq和PRIMER STAR做不出来，用它都能出来，但是如果按推荐体系，非特异扩增多了点。你的引物这么长，退火时间是不是要长点，而且如果退火温度较低，有可能有杂带
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-01-14 08:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +5 生物工程调剂 2026-03-17 9/450 2026-03-21 23:32 by zhujy1982
[考研] 286分人工智能专业请求调剂愿意跨考！ +4 lemonzzn 2026-03-17 8/400 2026-03-21 22:49 by lemonzzn
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +5 张vvvv 2026-03-15 7/350 2026-03-21 19:23 by ColorlessPI
[考研] 材料学学硕080502 337求调剂-一志愿华中科技大学 +4 顺顺顺mr 2026-03-18 5/250 2026-03-21 10:22 by luoyongfeng
[考研] 机械专硕299求调剂至材料 +3 kkcoco25 2026-03-16 4/200 2026-03-21 03:52 by JourneyLucky
[考研] 初始318分求调剂（有工作经验） +3 1911236844 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:33 by JourneyLucky
[考研] 材料 336 求调剂 +3 An@. 2026-03-18 4/200 2026-03-21 01:39 by JourneyLucky
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +15 陌の森林 2026-03-18 15/750 2026-03-20 23:28 by JourneyLucky
[考研] 321求调剂 +9 何润采123 2026-03-18 11/550 2026-03-20 23:19 by JourneyLucky
[考研] 330求调剂 +4 小材化本科 2026-03-18 4/200 2026-03-20 23:13 by JourneyLucky
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章 +22 rare12345 2026-03-18 22/1100 2026-03-20 20:39 by zhukairuo
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 3/150 2026-03-20 20:35 by 学员8dgXkO
[考研] 289求调剂 +6 怀瑾握瑜l 2026-03-20 6/300 2026-03-20 20:30 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 eation27 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:32 by JourneyLucky
[考研] 08工学调剂 +5 用户573181 2026-03-20 5/250 2026-03-20 15:47 by xia_2003
[考研] 085601材料工程专硕求调剂 +10 慕寒mio 2026-03-16 10/500 2026-03-19 15:26 by 丁丁*
[考研] 收复试调剂生 +4 雨后秋荷 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:16 by elevennnne
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭