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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助
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ikaren2013

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助

由于要做点突变，且突变位置很特殊很特殊，（考虑到突变位置，引物3'端配对长度），所以只能针对突变点限定性地设计了几对引物。 软件给出的Tm值相当高。相对于以下的结果图
       第一对引物 Tm
      
       第二对引物 Tm
      
       第三对引物 Tm
      
       第四对引物 Tm
      
       摸条件四次结果，都非常不好，（也用过热启动，什么都没P出来，只有引物二聚体），急求解决方法.目的片段大小约为700bp
      

      

       下图能看到每个体系都有十分微弱的目的条带      
      

       下图中的1,2,3为两点温度法
      

[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]
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1楼 2011-01-13 22:09:58
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
rainwander(金币+2):没操作过也没问题，积极参与的精神可嘉~~ 2011-01-15 10:52:21
我没做过定点突变，但是我觉得要考虑两个因素，一个是启始的引物模板mismatch，而且退火温度要根据真正匹配的部份来确定，好像设计引物的软件可以算出mismatch的退火温度，第二点要考虑mismatch不能太靠近三端吧，不然结合有问题。可以考虑一开始较低温度扩增，后提高温度。也可以设计一个长引物和然后去除其三端部份序列得到一个短引物，用两引物的混合物做为引物进行PCR，注意长引物量要小于短引物，至少1:5。一点拙见，呵呵，没实际操作过
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9楼2011-01-15 10:36:20
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):鼓励交流~~ 2011-01-14 09:07:17
我的引物都是20-26bp  没做过40bp的。。。。。
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2楼2011-01-13 23:51:13
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墨香若水

木虫 (著名写手)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2):热心的虫虫~~ 2011-01-14 09:08:07
强烈建议LZ换pfu酶，fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题，PCR要求没这么严格。关键是酶，KOD太矫情了。
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3楼2011-01-14 06:53:21
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-14 10:12:49
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-01-14 06:53:21:
强烈建议LZ换pfu酶，fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题，PCR要求没这么严格。关键是酶，KOD太矫情了。

KOD还好阿，用takara的extaq和PRIMER STAR做不出来，用它都能出来，但是如果按推荐体系，非特异扩增多了点。你的引物这么长，退火时间是不是要长点，而且如果退火温度较低，有可能有杂带
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4楼2011-01-14 08:16:44
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