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ikaren2013

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助

由于要做点突变，且突变位置很特殊很特殊，（考虑到突变位置，引物3'端配对长度），所以只能针对突变点限定性地设计了几对引物。软件给出的Tm值相当高。相对于以下的结果图
   第一对引物 Tm

   第二对引物 Tm

   第三对引物 Tm

   第四对引物 Tm

   摸条件四次结果，都非常不好，（也用过热启动，什么都没P出来，只有引物二聚体），急求解决方法.目的片段大小约为700bp




   下图能看到每个体系都有十分微弱的目的条带


   下图中的1,2,3为两点温度法


[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]

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1楼 2011-01-13 22:09:58

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shaquila

金虫 (正式写手)

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★ ★
rainwander(金币+2):没操作过也没问题，积极参与的精神可嘉~~ 2011-01-15 10:52:21

我没做过定点突变，但是我觉得要考虑两个因素，一个是启始的引物模板mismatch，而且退火温度要根据真正匹配的部份来确定，好像设计引物的软件可以算出mismatch的退火温度，第二点要考虑mismatch不能太靠近三端吧，不然结合有问题。可以考虑一开始较低温度扩增，后提高温度。也可以设计一个长引物和然后去除其三端部份序列得到一个短引物，用两引物的混合物做为引物进行PCR，注意长引物量要小于短引物，至少1:5。一点拙见，呵呵，没实际操作过