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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助
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ikaren2013

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助

由于要做点突变，且突变位置很特殊很特殊，（考虑到突变位置，引物3'端配对长度），所以只能针对突变点限定性地设计了几对引物。 软件给出的Tm值相当高。相对于以下的结果图
       第一对引物 Tm
      
       第二对引物 Tm
      
       第三对引物 Tm
      
       第四对引物 Tm
      
       摸条件四次结果，都非常不好，（也用过热启动，什么都没P出来，只有引物二聚体），急求解决方法.目的片段大小约为700bp
      

      

       下图能看到每个体系都有十分微弱的目的条带      
      

       下图中的1,2,3为两点温度法
      

[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]
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1楼 2011-01-13 22:09:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

baichangming

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
据说，引物的Tm值若是过高，直接两步PCR就可以了。
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17楼2013-11-19 17:52:15
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):鼓励交流~~ 2011-01-14 09:07:17
我的引物都是20-26bp  没做过40bp的。。。。。
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2楼2011-01-13 23:51:13
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墨香若水

木虫 (著名写手)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2):热心的虫虫~~ 2011-01-14 09:08:07
强烈建议LZ换pfu酶，fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题，PCR要求没这么严格。关键是酶，KOD太矫情了。
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3楼2011-01-14 06:53:21
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-14 10:12:49
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-01-14 06:53:21:
强烈建议LZ换pfu酶，fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题，PCR要求没这么严格。关键是酶，KOD太矫情了。

KOD还好阿，用takara的extaq和PRIMER STAR做不出来，用它都能出来，但是如果按推荐体系，非特异扩增多了点。你的引物这么长，退火时间是不是要长点，而且如果退火温度较低，有可能有杂带
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4楼2011-01-14 08:16:44
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2011-01-14 10:12:57
引物长度大于30bp的 退火温度不必参考软件上的TM。。。我的引物36bp，软件上面显示的退火温度高达80多度，50多度照样可以PCR。。。
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5楼2011-01-14 09:48:20
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
建议退火和延伸合成一步进行PCR啊
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6楼2011-01-14 10:05:32
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墨香若水

木虫 (著名写手)
楼主你突变用什么方法，Tm虽然高 但是跟模板结合的引物部分应该不是整个你的引物吧。
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7楼2011-01-14 11:24:04
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ikaren2013

金虫 (小有名气)
内容已删除
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8楼2011-01-14 11:33:08
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
rainwander(金币+2):没操作过也没问题，积极参与的精神可嘉~~ 2011-01-15 10:52:21
我没做过定点突变，但是我觉得要考虑两个因素，一个是启始的引物模板mismatch，而且退火温度要根据真正匹配的部份来确定，好像设计引物的软件可以算出mismatch的退火温度，第二点要考虑mismatch不能太靠近三端吧，不然结合有问题。可以考虑一开始较低温度扩增，后提高温度。也可以设计一个长引物和然后去除其三端部份序列得到一个短引物，用两引物的混合物做为引物进行PCR，注意长引物量要小于短引物，至少1:5。一点拙见，呵呵，没实际操作过
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9楼2011-01-15 10:36:20
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
是的，主要是引物片段太长了，不过换用好体系的话，还是不成问题的，好运！
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10楼2011-01-15 11:26:13
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haitian0625

金虫 (小有名气)
在考虑上面建议的同时，是否可以做下Mg离子梯度，敝人感觉镁离子有些多吧。
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11楼2011-01-15 16:12:44
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haitian0625

金虫 (小有名气)
期待楼主的解决方案分享啊！
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12楼2011-01-15 16:13:26
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墨香若水

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by ikaren2013 at 2011-01-14 11:33:08:

我用普通PCR拉目的片段。我的突变位置很特殊，位于目的片段的起始部分。不能用重叠PCR来做此突变。
我的引物长度39bp中，含有酶切位点和三个保护性碱基。（即使除去这些，剩下的31bp，Tm值依然很高。）剩下的3 ...

楼主如果只有一两个碱基突变 为什么不设计一对互补引物，其中突变点位于中间 突变点两端各有15~20bp pfu直接PCR获得nicked plasmid 再DPn1 消化模板
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13楼2011-01-15 22:05:27
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
要不做巢式PCR试试
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14楼2011-01-17 20:52:09
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madengyu

禁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
15楼2011-08-03 11:16:04
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btx362237729

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
279232楼: Originally posted by xulanzzz at 2011-01-14 09:48:20
引物长度大于30bp的 退火温度不必参考软件上的TM。。。我的引物36bp，软件上面显示的退火温度高达80多度，50多度照样可以PCR。。。

本人也遇到高TM值的问题了 哈哈。。。看到这个觉得很鼓舞
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16楼2012-06-16 20:33:07
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雾里看花花开

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
内容已删除
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18楼2014-03-26 12:38:40
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