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ikaren2013

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高，PCR求助

由于要做点突变，且突变位置很特殊很特殊，（考虑到突变位置，引物3'端配对长度），所以只能针对突变点限定性地设计了几对引物。软件给出的Tm值相当高。相对于以下的结果图
   第一对引物 Tm

   第二对引物 Tm

   第三对引物 Tm

   第四对引物 Tm

   摸条件四次结果，都非常不好，（也用过热启动，什么都没P出来，只有引物二聚体），急求解决方法.目的片段大小约为700bp




   下图能看到每个体系都有十分微弱的目的条带


   下图中的1,2,3为两点温度法


[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]

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1楼 2011-01-13 22:09:58

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墨香若水

木虫 (著名写手)

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引用回帖:

Originally posted by ikaren2013 at 2011-01-14 11:33:08:

我用普通PCR拉目的片段。我的突变位置很特殊，位于目的片段的起始部分。不能用重叠PCR来做此突变。
我的引物长度39bp中，含有酶切位点和三个保护性碱基。（即使除去这些，剩下的31bp，Tm值依然很高。）剩下的3 ...

楼主如果只有一两个碱基突变为什么不设计一对互补引物，其中突变点位于中间突变点两端各有15~20bp pfu直接PCR获得nicked plasmid 再DPn1 消化模板