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汕头大学海洋科学接受调剂
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ikaren2013

金虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】引物Tm值很高,PCR求助

由于要做点突变,且突变位置很特殊很特殊,(考虑到突变位置,引物3'端配对长度),所以只能针对突变点限定性地设计了几对引物。 软件给出的Tm值相当高。相对于以下的结果图
       第一对引物 Tm
      
       第二对引物 Tm
      
       第三对引物 Tm
      
       第四对引物 Tm
      
       摸条件四次结果,都非常不好,(也用过热启动,什么都没P出来,只有引物二聚体),急求解决方法.目的片段大小约为700bp
      

      

       下图能看到每个体系都有十分微弱的目的条带      
      

       下图中的1,2,3为两点温度法
      

[ Last edited by ikaren2013 on 2011-1-14 at 11:36 ]
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墨香若水

木虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by ikaren2013 at 2011-01-14 11:33:08:

我用普通PCR拉目的片段。我的突变位置很特殊,位于目的片段的起始部分。不能用重叠PCR来做此突变。
我的引物长度39bp中,含有酶切位点和三个保护性碱基。(即使除去这些,剩下的31bp,Tm值依然很高。)剩下的3 ...

楼主如果只有一两个碱基突变 为什么不设计一对互补引物,其中突变点位于中间 突变点两端各有15~20bp pfu直接PCR获得nicked plasmid 再DPn1 消化模板
13楼2011-01-15 22:05:27
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)



最爱花诗雨(金币+1):鼓励交流~~ 2011-01-14 09:07:17
我的引物都是20-26bp  没做过40bp的。。。。。
2楼2011-01-13 23:51:13
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墨香若水

木虫 (著名写手)


★ ★
最爱花诗雨(金币+2):热心的虫虫~~ 2011-01-14 09:08:07
强烈建议LZ换pfu酶,fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题,PCR要求没这么严格。关键是酶,KOD太矫情了。
3楼2011-01-14 06:53:21
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shaquila

金虫 (正式写手)


★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-14 10:12:49
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-01-14 06:53:21:
强烈建议LZ换pfu酶,fermentals的不错价格也便宜。我做突变没出过问题。Tm这些应该没问题,PCR要求没这么严格。关键是酶,KOD太矫情了。

KOD还好阿,用takara的extaq和PRIMER STAR做不出来,用它都能出来,但是如果按推荐体系,非特异扩增多了点。你的引物这么长,退火时间是不是要长点,而且如果退火温度较低,有可能有杂带
4楼2011-01-14 08:16:44
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