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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请帮忙，扩增长片段基因遇到困难了
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moonblue789

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请帮忙，扩增长片段基因遇到困难了

最近扩增一个基因碰到了困难，请大家帮帮忙，出出主意，集思广益。谢谢！
基因信息：长度3400bp，GC含量56%，退火温度（Oligo软件推荐）：59.8度。
做过温度梯度（56度到62度），用过GC buffer，也改变镁离子浓度（2.5mM）,用过某公司的Super Taq，也用过罗氏的扩增长片段的酶，都无能无力。
请各位帮忙了，谢谢！
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1楼2011-01-12 19:10:19
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luzeyan

金虫 (小有名气)
★
moonblue789(金币+1):谢谢参与
moonblue789(金币+2):引物没换过，模板换过的。谢谢！ 2011-01-12 19:49:25
引用回帖:
Originally posted by moonblue789 at 2011-01-12 19:10:19:
最近扩增一个基因碰到了困难，请大家帮帮忙，出出主意，集思广益。谢谢！
基因信息：长度3400bp，GC含量56%，退火温度（Oligo软件推荐）：59.8度。
做过温度梯度（56度到62度），用过GC buffer，也改变镁离子 ...

1.引物有没有问题？
2.换一个模板做做
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2楼2011-01-12 19:38:21
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
moonblue789(金币+1):谢谢参与
moonblue789(金币+1):是扩增不出来！ 2011-01-13 08:44:57
是量少呀还是不扩增呀？
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3楼2011-01-12 20:07:56
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
moonblue789(金币+1):谢谢参与
是什么材料啊也没说。
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4楼2011-01-12 20:23:46
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ma2007

银虫 (初入文坛)

用KOD试试

★
moonblue789(金币+1):谢谢参与
moonblue789(金币+2): 2011-01-13 08:41:59
用东洋纺的KOD酶试试，这个酶比较强悍，我们实验室常用。
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5楼2011-01-12 21:46:44
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★ ★
moonblue789(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 00:11:28
moonblue789(金币+2):谢谢！模板没问题，PCR体系没问题，现在就只能考虑引物了 2011-01-13 08:43:08
你是扩增不出来还是怎么回事？
3400真不算长的片段，
首先你得确定你的模板没有问题，扩个内参基因当做对照，如果是模板有问题，你怎么改变体系都是扩不出来的
其次，确定你的PCR体系是正确的，别少加东西了
再次，确定你的引物是否合适
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6楼2011-01-12 22:16:19
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JASON13

银虫 (小有名气)

我的经验

★ ★
moonblue789(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 00:11:10
moonblue789(金币+2):谢谢提供方法 2011-01-13 08:43:41
我刚刚成功扩增了2900bp的T7 pol 酶基因，可以先用LAtaq扩增，这种酶保真性不佳，但效率俱佳。获得片段后，测序后获得序列后，可以根据其在中间设计2-3个引物，再用overlap方法扩增。
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7楼2011-01-12 22:18:12
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):good 2011-01-14 10:08:44
一般的Taq酶基本上都能满足这个要求，一般需要对你的PCR引物修改一下，提高特异性和扩增效率，通过换Taq酶起到作用一般不是特别显著。加入PCR增量剂有助于提高PCR产物的量，前提也是在使用普通Taq酶的情况下，现在许多Taq酶中加入的乱七八糟的东西太多。
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8楼2011-01-14 09:16:57
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