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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 前沿资讯 » 【求助】多孔材料中细胞全液的提取方法
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王庭

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助】多孔材料中细胞全液的提取方法

我主要是做生物材料偏颇于生物检测这块的。为了将材料上的细胞和培养瓶中的细胞生长状况进行大分子方面的对比，就需要得到全细胞提取液以及RNA等。但是我在多孔材料中培养的细胞，粘附性太好了，导致用胰酶很难清洗下来，又不能消化太久，所以也就很难得到全细胞提取液，我尝试在材料中破碎细胞直接进行全液提取，可是结果也不太好。哪位正在做，或者头脑极为强大的大侠给出出主意啊，感激涕零哦~~~Sample Text
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1楼 2010-12-27 20:09:55
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王庭

木虫 (著名写手)
请大家多多帮忙啊，给点建议，做了近两个月了，结果一直不好，头大啊~
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2楼2010-12-27 20:15:34
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诺曼底1227

铁杆木虫 (正式写手)
★
yusen_1982(金币+1):欢迎讨论！ 2011-01-08 23:50:34
王庭(金币+2):谢谢哦 2011-01-12 20:12:01
为什么不试一下将细胞-材料放在液氮里面研磨，然后制成悬液，反复冻融裂解细胞，最后离心收集上清？
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3楼2011-01-08 21:46:58
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
★
yusen_1982(金币+1):欢迎讨论！ 2011-01-08 23:50:40
王庭(金币+2):谢谢了哦 2011-01-12 20:16:02
用细胞裂解液试试，把细胞全部裂解。
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4楼2011-01-08 21:55:58
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王庭

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 诺曼底1227 at 2011-01-08 21:46:58:
为什么不试一下将细胞-材料放在液氮里面研磨，然后制成悬液，反复冻融裂解细胞，最后离心收集上清？

我用的材料基体是碳，一旦研磨之后生成的碳粉一是会对细胞的蛋白产生影响，再就是在裂解后离心时，碳粉很难粘附在离心管底部，也就是说很不容易分离。
唉唉！！呵呵，仍旧要谢谢你呢~
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5楼2011-01-12 20:15:29
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王庭

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2011-01-08 21:55:58:
用细胞裂解液试试，把细胞全部裂解。

我之前确实也尝试了这个方法，当然这个方法也在我所有方法里面相对来说是最好的一个。只是由于是多孔材料，在清洗上面的培养液的时候不能像常规提取蛋白的方法那样可以PBS清洗、Washing buffer 清洗等等进行一系列的步骤，导致清洗不净，所以提出的蛋白含有一些培养液杂质；另外，裂解液用的量比较多，浪费倒是先不说了，呵呵只是得到的蛋白浓度相对太低，WB都没有办法检测了。。。持续纠结中啊。。不过这个方法应该还是有潜力改进的。
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6楼2011-01-12 20:21:33
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
★
americanyk(金币+1):欢迎常来 2011-01-15 19:06:19
引用回帖:
Originally posted by 王庭 at 2011-01-12 20:21:33:

我之前确实也尝试了这个方法，当然这个方法也在我所有方法里面相对来说是最好的一个。只是由于是多孔材料，在清洗上面的培养液的时候不能像常规提取蛋白的方法那样可以PBS清洗、Washing buffer 清洗等等进行一系 ...

贵在探索，加油
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7楼2011-01-12 20:22:13
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王庭

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2011-01-12 20:22:13:

贵在探索，加油

呵呵，不加油打气也没有办法了！做研究失败是必然的，成功是偶然的~
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8楼2011-01-12 20:26:53
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dj04164

木虫 (正式写手)
★ ★
americanyk(金币+2):谢谢回帖交流 2011-01-13 16:46:19
王庭(金币+2): 现在打算换方法了，查了很多文献，发现少有三维多孔支架材料提取全细胞液WB来检查蛋白的。开始觉得是对方没有采用分子生物学手段检测材料性能，现在看来这大概是个瓶颈，难于突破吧？！所以，换个地方打井了~呵呵，谢谢你 2011-03-09 15:35:28
一般的方法种植细胞，不会在孔中涨的很深吧，不知孔有多大。能想到的办法，可以用缓冲液多洗两遍再trypsin，trypsin用含edta的，并且最好是新的。另外，medium里的成分蛋白的部分主要是bsa，一般对WB干扰不大。
实在弄不下来是不是可以考虑换个细胞系，或者缩短培养时间。有的细胞贴壁很牢，而且随时间延长更牢。
cell scraper 试过没？连带表面样品一同刮掉。加裂解液后离心去除。
如果在样品上裂解就难免蛋白浓度过低，可以试试看蛋白纯化之后再wb。
祝好运
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9楼2011-01-13 09:29:35
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god1985

银虫 (小有名气)
★
americanyk(金币+1):谢谢回帖交流 2011-01-13 16:46:31
王庭(金币+2): 嗯，我是打算换方法了~呵呵 2011-03-09 15:31:44
我的多孔材料为5mm*5mm*3mm，静态培养，MTT很容易做，荧光也很容易渗透，可能要想个间接的方法来表征你需要表征的时间
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10楼2011-01-13 14:41:11
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jingwang7793

金虫 (小有名气)

细胞液提取

★ ★
americanyk(金币+2):谢谢 2011-01-15 19:06:47
王庭(金币+2): 很不错的方法~值得一试。 2011-03-10 15:18:10
用细胞裂解液,在真空条件下,让裂解液进入多空材料,在超声裂解.最后用副压泵,将裂解液吸出.回收即可.
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11楼2011-01-15 17:59:01
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爱狗的猫猫

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄酮: 金币+1, 谢谢回帖交流 2014-03-20 21:28:07
亲，三年过去了，你是咋解决的呢？？我现在也在做类似的实验，我是医学生，对这些不是很了解。。。
万分感谢！！！~
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12楼2014-03-20 21:02:26
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