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gwkzp木虫 (小有名气)
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求助：粪便中微生物细胞的提取方法？
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| 本人在做蛋白质组学实验，想知道把粪便中总的微生物细胞提取出来的方法，那位大侠有请帮我一下，谢谢！ |
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2楼2013-06-28 14:51:53
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3楼2013-06-29 15:27:11
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4楼2013-06-29 15:29:42
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【答案】应助回帖
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粪便DNA提取步骤： 取约1g湿重粪便样品，用35ml0.1mol/L的灭菌磷酸钠缓冲液（每升0.1M SPB含1M Na2HPO4 57.7ml，1M NaH2PO4 42.3ml，pH 7.4）悬浮，悬浮时先加15ml缓冲液充分漩涡振荡10分钟后，再加10ml缓冲液漩涡3－5分钟，最后再加10ml漩涡，使样本成均匀浑浊，除不溶的食物残渣外无大的凝结块。200×g离心5分钟，收集上清（菌体），弃去沉淀（渣滓）。重复200×g离心5分钟，收集上清（菌体），弃去沉淀（渣滓）步骤,重复2次。9000×g高速离心5分钟，弃去上清，收集沉淀（菌体）。收集的菌体用35ml 0.1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮，9000×g离心5分钟。重复9000×g高速离心5分钟，弃去上清，收集沉淀（菌体）步骤,重复2次。洗涤好的菌体悬浮在10ml 0.1mol/L磷酸钠缓冲液中，用枪吹打后旋涡震荡器上振荡混匀，平均分装至10个1.5ml Eppendorf管中，-20℃冻存，或者直接用于DNA提取。 取经过洗涤的一管菌体细胞。9000×g高速离心5分钟，弃上清。加入1ml buffer Z（10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)；150mmol/L NaCl），用枪吹打后旋涡震荡器上振荡 混匀。先将0.3g锆石珠（zirconium beads，直径0.1mm）加入击打管(screw tube)里，再将菌体细胞转移到击打管中。在击打管里加入150μl苯酚（pH8.0），拧紧盖子。（注：使用酚前要注意检查一下所用饱和酚的pH值是否是8；盖子一定要拧紧否则击打时会渗漏液体）。bead beater在最大速度击打4分钟，分3次击打，每次80s，每处理80s，将击打管在冰上放置1分钟（击打时间可根据自己的样本自行调整）。击打4分钟后，加入110μl 10%SDS，轻轻混合均匀后，冰上放置10分钟，每5分钟轻轻颠倒混匀。加入150μl氯仿/异戊醇（体积比为24：1）溶液，轻轻混匀。15,000×g离心10分钟。收集上清，约1100μl,平分在2个2ml的离心管中（每管约550μl）。分别加入1/10体积的3mol/L醋酸钠。加入等体积饱和酚，轻轻颠倒摇匀，15,000转/分离心10分钟，收集上清。（每次收集上清时，要小心不要吸到水相和有机相之间的蛋白层以及下层的氯仿/异戊醇）。加入等体积酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1）溶液，轻轻颠倒摇匀，15,000转/分离心10分钟，收集上清。加入等体积氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，15,000转/分离心10分钟，收集上清。加入2倍体积冰乙醇，-20℃沉淀2小时，为提高DNA提取效率，可沉淀过夜。15，000×g离心15分钟，弃去上清，沉淀为DNA（倒上清时一次性倒完，不能没倒完就立起离心管重复倒，注意不要将DNA倒掉，避免损失DNA）。1ml 70%乙醇洗涤，15,000×g离心15分钟，弃去上清，沉淀为DNA（倒上清时一次性倒完，不能没倒完就立起离心管重复倒，注意不要将DNA倒掉，避免损失DNA）。真空冷冻干燥后，溶于100μl无菌水中或TE缓冲液，加入10μl 20mg/L无DNA酶的RnaseA，37℃温浴30分钟。两管合并共200μl总DNA，取3μl 0.8%琼脂糖胶电泳检测DNA纯度与完整性，取2μl用DNA浓度仪（DyNAquant 200）测定所提DNA的浓度。DNA可以置于-20℃保存，用于后续分析。 |
5楼2013-06-29 17:27:36
