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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 我的放线菌细胞壁很难破，求助各位大虾
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syn1985

木虫 (正式写手)

[求助] 我的放线菌细胞壁很难破，求助各位大虾

我想构建基因组文库，可是前面DNA提取就很头疼，按照操作手册上写的加入2mg/ml的溶菌酶破壁，但是水浴2h都不行，后来我把溶菌酶的浓度提高到10mg/ml还是不行，有没有谁有好的破壁方法啊。
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1楼2011-05-03 17:25:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+5): 谢谢 不过不知道这样会不会对提取出来的DNA长度有影响呢 2011-05-04 15:34:20
rainwander: 一接种环的量是多少？ 2011-05-05 17:28:40
本人的经验，加粉末溶菌酶一接种环的量，然后过夜
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帮助虫友，提升自己
4楼2011-05-04 09:10:12
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newtime007

木虫 (正式写手)

成长的微生物

【答案】应助回帖

★
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-05-05 17:28:11
先将菌体液态培养至对数期，然后取菌体家溶菌酶溶解
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上善若水，水善利万物而不争
6楼2011-05-04 12:02:17
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summerstar

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

syn1985楼主的头像粉可爱，放线菌的细胞壁肯定能找到好方法的
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Ontheway! 学习的快乐！
8楼2011-05-04 16:22:55
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
syn1985(金币+3): 太谢谢了 我试试 2011-05-05 09:26:01
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-05-05 17:29:20
不会的，放线菌属于阳性菌，很难破壁，我以前是做红球菌的属于放线菌科，加大溶菌酶的用量，就直接加买回来的溶菌酶粉末的，破壁效果很好，DNA的长度与你提取操作轻柔有关，至于研磨的方法我也用过，提出的总DNA，效率很高，但容易成粉末絮状，做DNA杂交没有问题，建库不行
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帮助虫友，提升自己
9楼2011-05-04 16:29:31
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普通回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-05-05 17:27:42
可以试试经典的CTAB法
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-05-04 00:42:43
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narcissusS

金虫 (小有名气)

一叶秋鸿
最近也是在头疼于厚壁菌的破壁，占座听课
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想的复杂活得简单
3楼2011-05-04 08:53:31
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narcissusS

金虫 (小有名气)

一叶秋鸿
引用回帖:
Originally posted by charon1982 at 2011-05-04 09:10:12:
本人的经验，加粉末溶菌酶一接种环的量，然后过夜

可不可以稍微详细点说一下，谢谢啦~
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想的复杂活得简单
5楼2011-05-04 09:16:57
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liukgg

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
syn1985(金币+2): 谢谢 这个方法我试过 提取的DNA长度不够 2011-05-04 15:35:11
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-05-05 17:28:54
rainwander(EPI+1): 2011-05-05 17:29:50
建议用以下方法试一下：
取0.15g新鲜菌体于研钵(-20℃预冷)中,反复液氮研磨至细粉状,迅速平均分装至2个1.5mL离心管中;加TE Buffer 550μL,加65℃预热的20% SDS溶液30μL,漩涡振荡5s,加20mg/mL蛋白酶K 20μL,轻轻混匀,37℃保温1h;加等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提,轻微颠倒混匀,10000r/min离心10min;小心吸取上清至新离心管中,加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提,10000r/min离心5min,吸取上清液与等体积异丙醇(4℃预冷)混匀,然后10000r/min离心3min,弃上清。沉淀用1mL 70%乙醇(4℃预冷)洗涤1min,自然风干,加入40μL TE溶解,-20℃保存备用。
本人做过，效果还可以
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山水凤凰
7楼2011-05-04 14:24:37
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-05-05 17:29:32
还有一点，溶菌酶加多了，细胞壁多糖比较多的话，采用上面仁兄说的CTAB法，改进一下提取方式，祝你实验成功
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帮助虫友，提升自己
10楼2011-05-04 16:31:26
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