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syn1985

木虫 (正式写手)

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专业: 病原细菌与放线菌生物学

[求助] 我的放线菌细胞壁很难破，求助各位大虾

我想构建基因组文库，可是前面DNA提取就很头疼，按照操作手册上写的加入2mg/ml的溶菌酶破壁，但是水浴2h都不行，后来我把溶菌酶的浓度提高到10mg/ml还是不行，有没有谁有好的破壁方法啊。

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1楼2011-05-03 17:25:07

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liukgg

木虫 (小有名气)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
syn1985(金币+2): 谢谢这个方法我试过提取的DNA长度不够 2011-05-04 15:35:11
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-05-05 17:28:54
rainwander(EPI+1): 2011-05-05 17:29:50

建议用以下方法试一下：
取0.15g新鲜菌体于研钵(-20℃预冷)中,反复液氮研磨至细粉状,迅速平均分装至2个1.5mL离心管中;加TE Buffer 550μL,加65℃预热的20% SDS溶液30μL,漩涡振荡5s,加20mg/mL蛋白酶K 20μL,轻轻混匀,37℃保温1h;加等体积Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提,轻微颠倒混匀,10000r/min离心10min;小心吸取上清至新离心管中,加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提,10000r/min离心5min,吸取上清液与等体积异丙醇(4℃预冷)混匀,然后10000r/min离心3min,弃上清。沉淀用1mL 70%乙醇(4℃预冷)洗涤1min,自然风干,加入40μL TE溶解,-20℃保存备用。
本人做过，效果还可以