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[交流]
【交流】做体外转录总卡在产量和纯度？分享一款实验室长期在用的 T7 酶
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经常做体外转录合成 RNA 探针、siRNA 的同行应该都有同感，选对 T7 聚合酶能省下超多重复实验。 之前我试过好几款市面常见酶，小试看着数据还行，一要大批量制备 RNA 就各种出问题：要么扩体系后产量直接缩水，为了凑足量样品只能不停配小管，质粒、NTP 消耗特别快；还有的酶转录完双链杂质很多，后续做细胞转染背景杂乱，额外纯化也很难清理干净。加上不少产品只单独卖酶，镁离子、亚精胺、DTT 都要自己单独配，每次开实验前光是准备缓冲液就要耗很久。 我们实验室经常需要制备毫克级 RNA 做结构和体外功能实验，前后对比筛选后，现在一直稳定在用这款 T7 RNA 聚合酶，这段时间积累了不少实操经验，简单分享给有相同需求的虫友做参考。 先说下基础情况，货号 DGN01，酶活浓度 50 U/μL，蛋白纯度能到 95% 以上，分子量 99 kDa，分 5000U 和 25000U 两种规格，不管是少量摸索条件，还是长期大量合成都合适。-20℃存放一整年活性都很稳定，不用频繁补货。 商家直接配套好 10× 转录缓冲液和单独 DTT 溶液，不用自己凑试剂；储存缓冲里甘油含量高，分装时短暂拿出来室温放置，也不用担心酶快速失活。酶活标定标准统一，37℃ pH8 条件下 1 小时掺入 1nmol GMP 即为 1 单位，不同批次活性差异很小，不用每次实验重新调整加酶量。 日常我们通用 20μL 小体系操作起来很省心：水补到 20μL，搭配配套缓冲、DTT、四种 NTP、RNase 抑制剂，模板 DNA 区间 20ng–1μg，加入 50U 酶，37℃孵育 1~2 小时就能完成转录。 顺便说两个实操小细节：模板下游切成平端或 5’突出末端，RNA 产出会更高；缓冲里含有亚精胺，核酸浓度高的时候出现少量沉淀不用慌，不影响整体转录效果。 实际用下来感受比较明显的几点： 反应体系好放大，不会出现产量断崖下跌，稳定产出毫克级 RNA，不用反复配制几十管小反应，能省下不少昂贵耗材； 只特异性识别 T7 启动子，不会乱结合其他启动子产生杂条带，dsRNA 副产物少，后续细胞实验的干扰会低很多； 全套缓冲液配齐，省去自己称量、配制多种添加剂的步骤，也能减少人为配液带来的误差； 蛋白纯度高，杂蛋白少，转录后的 RNA 不管是跑胶、色谱纯化还是体外互作实验，背景都更干净。 客观说下它的局限，方便大家按需判断： 只能识别 T7 启动子，如果你的载体是 T3、SP6 启动子就没法用；体系里残留高浓度 EDTA、变性剂会大幅压制酶活，模板洗脱后尽量除净残留；另外酶液不适合反复冻融，收到后建议分装成单次用量保存。 市面上既能放大反应、又能控制杂链 RNA 的 T7 酶不算多，不少课题组小试没问题，批量制备就踩坑。如果你平时经常大批量合成各类 RNA，手上现用的酶达不到预期，想拿少量样品做平行对照对比效果，可以站内私信我，顺便把我们实验室摸索出来的放大体系配比分享给你，少走点试错弯路。 大家平时做体外转录有没有遇到产量低、杂 RNA 多的难题？楼下可以一起聊聊各自的解决小技巧。 |
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