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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DGGE遇到了难题，向大家求助！
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mars20081587

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DGGE遇到了难题，向大家求助！已有6人参与

最近在做水体里细菌的V3区DGGE，引物是341f-GC和907r（参考国内外文献），我把同一个DNA模板用了不同的PCR方法跑琼脂糖电泳胶，求得最好的方法，然后用这些PCR产物跑DGGE胶，40%-64%，6%胶，明明PCR条带很亮，可是DGGE的条带却都不清晰，请教各位高手，希望能得到解答，第一张图片是PCR的图，第二张是DGGE的图。
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1楼2010-12-13 20:23:22
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biocontrol

金虫 (小有名气)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励回答 2010-12-14 12:45:53
我以前的办法是把PCR产物浓缩2倍或者3倍。这样DGGE条带会清楚，但是背景颜色也会相应变重。
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裸奔进行时...
2楼2010-12-14 08:53:19
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tsq0126

金虫 (小有名气)

求助

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Originally posted by mars20081587 at 2010-12-13 20:23:22:
最近在做水体里细菌的V3区DGGE，引物是341f-GC和907r（参考国内外文献），我把同一个DNA模板用了不同的PCR方法跑琼脂糖电泳胶，求得最好的方法，然后用这些PCR产物跑DGGE胶，40%-64%，6%胶，明明PCR条带很亮，可是 ...

同学，你的问题解决了吗？我现在和你面临一样的问题，帮帮忙。
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3楼2011-01-06 14:44:29
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tsq0126

金虫 (小有名气)
★
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Originally posted by tsq0126 at 2011-01-06 14:44:29:




同学，你的问题解决了吗？我现在和你面临一样的问题，帮帮忙。



这两个图是我的V3片段的PCR产物和DGGE的结果，同学相信你的问题已经解决了吧，我现在也遇到瓶颈啦，希望得到你的帮助。
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4楼2011-01-06 14:54:23
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by tsq0126 at 2011-01-06 14:54:23:




这两个图是我的V3片段的PCR产物和DGGE的结果，同学相信你的问题已经解决了吧，我现在也遇到瓶颈啦，希望得到你的帮助。

什么染色方法啊？EB还是银染？
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5楼2011-01-07 14:48:02
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tsq0126

金虫 (小有名气)

急急急急急急

★
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Originally posted by xiadongliang at 2011-01-07 14:48:02:



什么染色方法啊？EB还是银染？

我用的是稀释一万倍的SYBR Green I，避光染色三十分钟的效果。
现在就是不知道哪个环节出现问题啦，我就是按照以前有个学姐的方法来做的。她的图就很好，不过她现在毕业啦，好多细节的东西不太清楚。各位大虾帮帮忙。
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6楼2011-01-08 09:20:35
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在雨中

金虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-08 12:22:53
我一般使用338F 518R的引物做DGGE。341F和907R引物扩增的片段太长，不容易分离，得不出好图。
我觉得你们的胶有问题。
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7楼2011-01-08 10:28:46
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tsq0126

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by 在雨中 at 2011-01-08 10:28:46:
我一般使用338F 518R的引物做DGGE。341F和907R引物扩增的片段太长，不容易分离，得不出好图。
我觉得你们的胶有问题。

做胶的各种试剂是从上海生工买的，很多人建议用SIGMA的，不过我们做的不多，买进口的太贵了，就买了国产的了。
制胶过程有什么需要特别注意的地方吗？
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8楼2011-01-08 14:06:02
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
★
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Originally posted by tsq0126 at 2011-01-08 14:06:02:




做胶的各种试剂是从上海生工买的，很多人建议用SIGMA的，不过我们做的不多，买进口的太贵了，就买了国产的了。
制胶过程有什么需要特别注意的地方吗？

338F  518R这个引物是没有问题的。用的也比较广泛。

染色方法仔细分析一下吧。
目前比较常用的方法还是银染。
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9楼2011-01-09 14:27:44
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分子实验哥

捐助贵宾 (小有名气)
★
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北京华美锐是一家专门代做DGGE实验的单位
1.技术路线如下﹕
客户提供样本，公司负责从样本中提取DNA，设计与合成检测片段特异性PCR引物， PCR扩增，PCR产物纯化，变性梯度凝胶电泳，PAGE切胶回收，二次PCR扩增，琼脂糖切胶回收，TA克隆测序，生物信息学分析对PCR产物进行单向测序后分析所检测信息。
2.我们为您提供的结果
提交结果包括：PCR结果的胶图、PCR产物的变性梯度凝胶电泳分析图、主要电泳条带的序列测定及其序列分析、测序峰图及序列，测序结果分析报告。
有需要代做DGGE实验的朋友请联系              18910397186   周
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10楼2011-12-14 09:11:23
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