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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于连接转化 急需！
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dizi1987

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于连接转化 急需！ 已有3人参与

我做了两次连接转化，情况如下
目的基因与质粒载体连接后 ，电击转化大肠杆菌，用抗生素筛选培养一段时间后 ，可见单菌落。挑取单菌落培养 提质粒，电泳检测，无条带。用质粒扩PCR，可见目的条带。这是怎么回事？希望高手指点，下一步是准备将重组质粒转入真核细胞进行表达。
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1楼 2010-12-08 16:09:44
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:49:10
最好线性化，增加重组的几率，但是呢，线性化使得转化效率下降，因为空间位阻增大了撒，电转好些，什么氯化锂的啥，不要做了~
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4楼2010-12-09 10:32:16
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:48:59
可能质粒提取的量太少了，虽然电泳看不到，但是PCR只需要微量模板就能扩增出来的
可以：尝试菌落PCR；
既然PCR出来目的条带，就送去测序看看是不是你的插入片段吧，
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2楼2010-12-08 18:43:55
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dizi1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2010-12-08 18:43:55:
可能质粒提取的量太少了，虽然电泳看不到，但是PCR只需要微量模板就能扩增出来的
可以：尝试菌落PCR；
既然PCR出来目的条带，就送去测序看看是不是你的插入片段吧，

呵呵 谢谢！ 还想请教一下 ，重组质粒电击转化酵母时 ，是否一定要线性化？
如果是的话，就需要大量的重组质粒进行单酶切并回收，这样的话，岂不是又要重新连接转化大肠杆菌，直到能提取出足够量的重组质粒？
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3楼2010-12-09 10:29:34
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dizi1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-12-09 10:32:16:
最好线性化，增加重组的几率，但是呢，线性化使得转化效率下降，因为空间位阻增大了撒，电转好些，什么氯化锂的啥，不要做了~

O(∩_∩)O~ 谢谢哈
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5楼2010-12-09 11:17:32
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