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dizi1987

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于连接转化 急需! 已有3人参与

我做了两次连接转化,情况如下
目的基因与质粒载体连接后 ,电击转化大肠杆菌,用抗生素筛选培养一段时间后 ,可见单菌落。挑取单菌落培养 提质粒,电泳检测,无条带。用质粒扩PCR,可见目的条带。这是怎么回事?希望高手指点,下一步是准备将重组质粒转入真核细胞进行表达。
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dizi1987

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2010-12-08 18:43:55:
可能质粒提取的量太少了,虽然电泳看不到,但是PCR只需要微量模板就能扩增出来的
可以:尝试菌落PCR;
既然PCR出来目的条带,就送去测序看看是不是你的插入片段吧,

呵呵 谢谢! 还想请教一下 ,重组质粒电击转化酵母时 ,是否一定要线性化?
如果是的话,就需要大量的重组质粒进行单酶切并回收,这样的话,岂不是又要重新连接转化大肠杆菌,直到能提取出足够量的重组质粒?
3楼2010-12-09 10:29:34
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:48:59
可能质粒提取的量太少了,虽然电泳看不到,但是PCR只需要微量模板就能扩增出来的
可以:尝试菌落PCR;
既然PCR出来目的条带,就送去测序看看是不是你的插入片段吧,
2楼2010-12-08 18:43:55
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liyong1981

金虫 (正式写手)


★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:49:10
最好线性化,增加重组的几率,但是呢,线性化使得转化效率下降,因为空间位阻增大了撒,电转好些,什么氯化锂的啥,不要做了~
4楼2010-12-09 10:32:16
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dizi1987

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-12-09 10:32:16:
最好线性化,增加重组的几率,但是呢,线性化使得转化效率下降,因为空间位阻增大了撒,电转好些,什么氯化锂的啥,不要做了~

O(∩_∩)O~ 谢谢哈
5楼2010-12-09 11:17:32
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