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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于western 求助，高手请帮帮忙
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neversaydi

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于western 求助，高手请帮帮忙 已有8人参与

我想跑185kd的蛋白。
想问一下，这样的话，
1.浓缩胶和分离胶应该各用多少浓度的啊？
2.转膜和电泳的时候应该怎么个条件啊。
因为第一次做，所有求教一下，请各位大师大侠不吝赐教，小女子在这里叩谢啦
谢谢
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neverdaydie!
1楼 2010-12-07 12:45:11
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bingdong05

银虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-09 11:54:28
185kd，8%的胶应该可以，上层胶一般都是3%的，另外条件要根据你的膜以及转膜仪器来定
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2楼2010-12-07 16:31:46
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neversaydi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bingdong05 at 2010-12-07 16:31:46:
185kd，8%的胶应该可以，上层胶一般都是3%的，另外条件要根据你的膜以及转膜仪器来定

一般跑60KD左右，是电泳80V  2h左右，转膜300MA  90min。
那这样的话，180KD应该是怎么个条件呢？谢谢大师指点
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neverdaydie!
3楼2010-12-07 18:47:01
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:54:37
如果你有预染的蛋白marker的话，可以通过蛋白marker来确定，
如果没有的话100V 2 hours 应该可以，转膜时间最好长一点semi-dry可以2-3hours
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有勇气去改变你可以改变的,有度量去容忍你不能改变的,有智慧去区分上面的两种情况http://bbs.bioon.net/bbs/?66210
4楼2010-12-08 04:47:11
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neversaydi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangleisdnu at 2010-12-08 04:47:11:
如果你有预染的蛋白marker的话，可以通过蛋白marker来确定，
如果没有的话100V 2 hours 应该可以，转膜时间最好长一点semi-dry可以2-3hours

我一般都是湿转。
如果按照60 KD，我是80V 2H，转膜300mA 90min 的话，
  180KD大概是个什么条件呢？谢谢
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neverdaydie!
5楼2010-12-08 10:33:22
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bingdong05

银虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-13 08:55:52
湿转 没有用过，一般用得都是半干的方法，你先按照原来的方法试试，效果不好的话可以适当延长时间
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6楼2010-12-09 10:19:28
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wenjunlin

木虫 (小有名气)
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dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-13 08:56:08
我觉得，转膜300mA 90min足够了，你可以先试做一下。。。

我的是90KD左右，350mA，100V转膜1h，效果还是不错的。。。。

电泳配胶，你可以查下一些文献，应该都有的
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7楼2010-12-12 16:23:13
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neversaydi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wenjunlin at 2010-12-12 16:23:13:
我觉得，转膜300mA 90min足够了，你可以先试做一下。。。

我的是90KD左右，350mA，100V转膜1h，效果还是不错的。。。。

电泳配胶，你可以查下一些文献，应该都有的

300mA  90min  是60KD蛋白的转膜条件。这个我知道。我是想问180KD是个什么条件。大侠，辛苦下，再指教下。。。呵呵 谢谢
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neverdaydie!
8楼2010-12-13 08:41:36
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wenjunlin

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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看天(金币+2):鼓励回答 2010-12-14 12:32:26
我看了一下Bio-Rad的说明书，一个是30V，90mA，过夜，另一个是100V，350mA，1小时。。没有提到不同分子量蛋白质要不同的条件，我觉得100V，350mA，1小时，应该也适合你的蛋白的，不过要转膜过程要冰浴，350mA电流会产生很多热量
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9楼2010-12-13 13:04:28
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shuaisuo1984

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
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看天(金币+4):鼓励新宠多交流 2010-12-14 12:32:40
我们一般180KD的转膜是40v，3h，湿转，都能出来。希望对你有帮助~~~
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10楼2010-12-14 11:01:13
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