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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现

最近做载体构建，很不顺。
主要是把酶切后的片段（约2000bp)连到载体上，转化后总是没有菌落出现。
前些天相同的位置连了另一条片段出现了很多克隆，测序也是对的，现在真是很迷茫（感态应该没问题，因为用的同一批；T4Ligase应该也没问题）

[ Last edited by zhangxn2010 on 2010-12-4 at 09:37 ]

PS:本帖中问题已在2011年解决，当时没有放上具体原因，现做说明，以对有相关问题的虫友有启发。
用相当长的时间排除，最后在电泳液上找出了问题，第一个载体构建完之前一直选用TAE做缓冲液，后来一个刚来的海归博士建议用TBE（理由当然是条带清楚之类的），噩梦就开始了，原来是TBE和胶回收试剂盒有冲突，造成回收产物不能进行连接。
希望虫子们多注意小细节，我因为这点失误耽误近两月，领导眼都快绿了（当然还有其他并行工作，否则直接被炒掉了）。

[ Last edited by zhangxn2010 on 2012-12-11 at 15:10 ]
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1楼 2010-12-04 08:25:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sobi

新虫 (初入文坛)
★
rainwander(金币+1):注意细节是关键，尤其是载体与目的片段的比例 2010-12-06 13:52:13
zhangxn2010(金币+1):谢谢，我会注意的 2010-12-07 12:50:37
zhangxn2010(金币+1): 2011-03-14 13:04:28
我觉得分子实验是非常精细的活，最好每步都做到定性定量，这样才能够在实验失败的时候更加方便快捷的找到实验失败的原因。至于酶切连接，说起来挺简单的，但是细节很重要，希望楼主继续加油，找到原因，祝成功
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7楼2010-12-06 12:28:47
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普通回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)
自己顶一下，希望大家来讨论。
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2楼2010-12-04 09:38:04
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-04 10:40:55
zhangxn2010(金币+2):是个好办法，我再试试看 2010-12-04 13:30:10
zhangxn2010(金币+1): 2010-12-06 11:33:59
你不是已经在同一位置连过了吗，可以用这个载体切胶回收后和你的新的片段连接，这时加大浓度，调整比例。
当然也可能是引物合成错误，我遇到过。怎么都连接不上，后来重合成相同引物就很顺利的连上了。
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3楼2010-12-04 10:35:50
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
这个版块人很多啊，为什么没有很多人来我的帖子，继续求助.......
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4楼2010-12-06 11:32:35
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飞侠8683

新虫 (小有名气)
zhangxn2010(金币+1):我觉得如果酶切不好的话，比如没切开，载体会自连，然后也会出相应菌落啊 2010-12-06 12:22:49
有可能是你目的片段酶切效果不好
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5楼2010-12-06 11:36:49
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雪晨

金虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-06 12:15:58
zhangxn2010(金币+2):Solution1可以用于粘末端连接吗？ 2010-12-06 12:21:39
zhangxn2010(金币+1): 2010-12-06 12:21:53
你可以调整载体和片段的比例重新连接，或者你试着用T载体的Solution I 做连接，效果还不错的！
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6楼2010-12-06 11:56:11
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tsingo

金虫 (正式写手)
zhangxn2010(金币+1): 2010-12-07 12:50:53
适当增加连接时间，大片段连接到载体上的效率低一些
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8楼2010-12-06 12:46:22
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★ ★
zhangxn2010(金币+1):原来没看过这个操作，试试看 2010-12-07 12:53:25
zhangxn2010(金币+2): 2010-12-07 12:56:22
lstt09nk(金币+2): 感谢分享~ 2011-03-14 09:16:58
1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min，破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入连接酶
4 16度连接过夜


另外，做好阴性和阳性对照
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9楼2010-12-06 16:31:27
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)
zhangxn2010(金币+1): 2010-12-07 12:54:36
同病相怜，以前是一个不长，现在是长了都不是！
在多次总结后明白，问题出在了质粒上，重新提的新质粒，做酶切，完事后，立刻做连接！把感受态也换了吧，试试……
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10楼2010-12-06 16:56:41
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雪晨

金虫 (小有名气)
zhangxn2010(金币+1):thank you 2010-12-08 12:19:39
呵呵，Solution I 可以用于粘末端的连接，我以前做过的！
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11楼2010-12-07 20:43:17
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★
zhangxn2010(金币+2): 2010-12-08 11:39:13
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-08 12:22:18
这个原因其实很多，你说还连了另一个片段，是要再连一段形成2个片段的串联？两个末端的酶切位点一致么？和第二段另一个酶切位点buffer的兼容性呢？还有  这第二个片段酶切完全了没有？酶切问题很难确定不是说你把东西加进去就可以切开的，个人觉得是没有切开...切开了多少回连上一些的....再就是连接的问题...多做几个l连接比例试试...转化时感受态细胞浓度也不要太浓了...
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12楼2010-12-08 11:27:43
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by YaYa785 at 2010-12-08 11:27:43:
这个原因其实很多，你说还连了另一个片段，是要再连一段形成2个片段的串联？两个末端的酶切位点一致么？和第二段另一个酶切位点buffer的兼容性呢？还有  这第二个片段酶切完全了没有？酶切问题很难确定不是说你把 ...

是这样的，我构建的载体可以放两个不同来源但是相同功能的基因，这两段基因我设计的酶切位点都一样，只是想看看不同来源基因表达量有什么不同，先把一段基因已经连上了，另外一段怎么也连不上，所以来求助。
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13楼2010-12-08 12:18:53
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YaYa785

银虫 (小有名气)
zhangxn2010(金币+1): 2011-03-14 13:03:46
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2010-12-08 12:18:53:

是这样的，我构建的载体可以放两个不同来源但是相同功能的基因，这两段基因我设计的酶切位点都一样，只是想看看不同来源基因表达量有什么不同，先把一段基因已经连上了，另外一段怎么也连不上，所以来求助。

嗯明白了...一步一步排除原因吧...
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14楼2010-12-08 12:24:02
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
zhangxn2010(金币+2): 最近发现问题了，其实是电泳缓冲液效果不好，建议更换新鲜的TAE 2011-03-14 08:36:54
最近也在做四个载体的构建，两个互补载体，两个GFP定位载体，第一次抱侥幸的心理，回收的载体和目的片段浓度不大，6ul跑胶模糊刚能看到，连了几次均以失败告终，折腾了将近两周无果。后来加大了片段和载体的量，回首时检测条带十分亮，10ul体系连接，16度过夜，都长了斑，初步的载体引物PCR鉴定正确，测序中。。。
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15楼2011-03-13 21:39:32
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傲娇的小马尾

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-03-13 21:39:32
最近也在做四个载体的构建，两个互补载体，两个GFP定位载体，第一次抱侥幸的心理，回收的载体和目的片段浓度不大，6ul跑胶模糊刚能看到，连了几次均以失败告终，折腾了将近两周无果。后来加大了片段和载体的量，回首 ...

同回收的片段与载体不亮，想问问您的连接体系？
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16楼2017-07-26 18:25:10
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