24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zhangxn2010

木虫 (著名写手)

MolEPI: 1
应助: 14 (小学生)
金币: 2450.9
帖子: 2880
在线: 284小时
虫号: 972619

[交流] 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现

最近做载体构建，很不顺。
主要是把酶切后的片段（约2000bp)连到载体上，转化后总是没有菌落出现。
前些天相同的位置连了另一条片段出现了很多克隆，测序也是对的，现在真是很迷茫（感态应该没问题，因为用的同一批；T4Ligase应该也没问题）

[ Last edited by zhangxn2010 on 2010-12-4 at 09:37 ]

PS:本帖中问题已在2011年解决，当时没有放上具体原因，现做说明，以对有相关问题的虫友有启发。
用相当长的时间排除，最后在电泳液上找出了问题，第一个载体构建完之前一直选用TAE做缓冲液，后来一个刚来的海归博士建议用TBE（理由当然是条带清楚之类的），噩梦就开始了，原来是TBE和胶回收试剂盒有冲突，造成回收产物不能进行连接。
希望虫子们多注意小细节，我因为这点失误耽误近两月，领导眼都快绿了（当然还有其他并行工作，否则直接被炒掉了）。

[ Last edited by zhangxn2010 on 2012-12-11 at 15:10 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

DSC一次升温曲线出现熔融双峰是什么原因二次升温会不会只出现一个峰已经有4人回复
有机问高分子的问题！~！蛋白连接，金币可追加，求大神已经有13人回复
哪位大侠做过高分子的连接反应？谢谢了。已经有5人回复
求几个中国搞纳米材料的牛的重点实验室@一些关于纳米氧化锌的文章（名字即可）！已经有28人回复
连接转化出现很多微小的菌落已经有14人回复
磷酸铁锂专利无效案中方胜出几成定局已经有8人回复
几篇有关贵金属nps、core-shell、异质结合成、制备、性质、应用的Chemical reviews 已经有403人回复
单菌落的获得要经过几次培养？已经有16人回复
帮忙分析一下这几个响应面的图已经有16人回复
求助，MS培养中出现红色菌落，这是什么菌？已经有11人回复
虚心请教关于平—粘末端的连接问题已经有18人回复
为什么我在培养基上点菌的时候旁边总是会出现多余的菌落！！！！已经有20人回复
连接转化后菌落PCR验证出现非特异性扩增已经有5人回复
克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？已经有17人回复
【求助/交流】连接产物转化后菌落PCR正确，提取的质粒却比空质粒还小？已经有4人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2010-12-04 08:25:19

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

YaYa785

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 386.3
帖子: 68
在线: 16.5小时
虫号: 526422

zhangxn2010(金币+1): 2011-03-14 13:03:46

引用回帖:

Originally posted by zhangxn2010 at 2010-12-08 12:18:53:

是这样的，我构建的载体可以放两个不同来源但是相同功能的基因，这两段基因我设计的酶切位点都一样，只是想看看不同来源基因表达量有什么不同，先把一段基因已经连上了，另外一段怎么也连不上，所以来求助。

嗯明白了...一步一步排除原因吧...