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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

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应助: 14 (小学生)
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在线: 284小时
虫号: 972619

[交流] 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现

最近做载体构建，很不顺。
主要是把酶切后的片段（约2000bp)连到载体上，转化后总是没有菌落出现。
前些天相同的位置连了另一条片段出现了很多克隆，测序也是对的，现在真是很迷茫（感态应该没问题，因为用的同一批；T4Ligase应该也没问题）

[ Last edited by zhangxn2010 on 2010-12-4 at 09:37 ]

PS:本帖中问题已在2011年解决，当时没有放上具体原因，现做说明，以对有相关问题的虫友有启发。
用相当长的时间排除，最后在电泳液上找出了问题，第一个载体构建完之前一直选用TAE做缓冲液，后来一个刚来的海归博士建议用TBE（理由当然是条带清楚之类的），噩梦就开始了，原来是TBE和胶回收试剂盒有冲突，造成回收产物不能进行连接。
希望虫子们多注意小细节，我因为这点失误耽误近两月，领导眼都快绿了（当然还有其他并行工作，否则直接被炒掉了）。

[ Last edited by zhangxn2010 on 2012-12-11 at 15:10 ]

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1楼 2010-12-04 08:25:19

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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

zhangxn2010(金币+2): 最近发现问题了，其实是电泳缓冲液效果不好，建议更换新鲜的TAE 2011-03-14 08:36:54

最近也在做四个载体的构建，两个互补载体，两个GFP定位载体，第一次抱侥幸的心理，回收的载体和目的片段浓度不大，6ul跑胶模糊刚能看到，连了几次均以失败告终，折腾了将近两周无果。后来加大了片段和载体的量，回首时检测条带十分亮，10ul体系连接，16度过夜，都长了斑，初步的载体引物PCR鉴定正确，测序中。。。

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