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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现

最近做载体构建，很不顺。
主要是把酶切后的片段（约2000bp)连到载体上，转化后总是没有菌落出现。
前些天相同的位置连了另一条片段出现了很多克隆，测序也是对的，现在真是很迷茫（感态应该没问题，因为用的同一批；T4Ligase应该也没问题）

[ Last edited by zhangxn2010 on 2010-12-4 at 09:37 ]

PS:本帖中问题已在2011年解决，当时没有放上具体原因，现做说明，以对有相关问题的虫友有启发。
用相当长的时间排除，最后在电泳液上找出了问题，第一个载体构建完之前一直选用TAE做缓冲液，后来一个刚来的海归博士建议用TBE（理由当然是条带清楚之类的），噩梦就开始了，原来是TBE和胶回收试剂盒有冲突，造成回收产物不能进行连接。
希望虫子们多注意小细节，我因为这点失误耽误近两月，领导眼都快绿了（当然还有其他并行工作，否则直接被炒掉了）。

[ Last edited by zhangxn2010 on 2012-12-11 at 15:10 ]
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1楼 2010-12-04 08:25:19
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★ ★
zhangxn2010(金币+1):原来没看过这个操作，试试看 2010-12-07 12:53:25
zhangxn2010(金币+2): 2010-12-07 12:56:22
lstt09nk(金币+2): 感谢分享~ 2011-03-14 09:16:58
1 将目的片段与载体按比例混匀
2  65-70度热击2-3Min，破坏目的片段与载体的二级结构
3 加入连接酶
4 16度连接过夜


另外，做好阴性和阳性对照
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9楼2010-12-06 16:31:27
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
自己顶一下，希望大家来讨论。
赞一下 回复此楼
2楼2010-12-04 09:38:04
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-04 10:40:55
zhangxn2010(金币+2):是个好办法，我再试试看 2010-12-04 13:30:10
zhangxn2010(金币+1): 2010-12-06 11:33:59
你不是已经在同一位置连过了吗，可以用这个载体切胶回收后和你的新的片段连接，这时加大浓度，调整比例。
当然也可能是引物合成错误，我遇到过。怎么都连接不上，后来重合成相同引物就很顺利的连上了。
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3楼2010-12-04 10:35:50
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
这个版块人很多啊，为什么没有很多人来我的帖子，继续求助.......
赞一下 回复此楼
4楼2010-12-06 11:32:35
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